E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性
2022-02-04董超张丽君
董超,张丽君
(中国医科大学附属第一医院血液内科,沈阳 110001)
含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2,WWP2)是NEDD4样蛋白家族中的一种E3泛素连接酶[1-2]。它可将泛素连接至靶蛋白,并促使蛋白酶体降解靶蛋白[3-4]。E3泛素化连接酶参与了氧化应激相关过程,在多种疾病的发生发展中发挥重要的调控作用[3-5]。研究[6-9]表明,泛素化与肿瘤的发生密切相关,与血液系统疾病,如淋巴瘤、骨髓瘤、再生障碍性贫血、急性白血病也有一定联系。p21,也称CDKN1A/CIP1/WAF1/SDI1,是首个被鉴定出的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)复合物抑制剂[10],最近的研究发现,p21在抑制肿瘤中发挥重要作用,可能成为新治疗策略的重点。目前已报道的WWP2底物有Gsc、PTEN、TGFβ、Smads、EGR2以 及Oct4等[11-15]。然 而,WWP2与p21之间的作用尚不清楚。因此,本研究拟探讨E3泛素连接酶WWP2与p21的相互作用,及WWP2通过蛋白酶体途径降解p21的机制,为肿瘤的治疗及研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
HEK 293T细胞系(人肾上皮细胞系衍生株)来自中国医科大学健康科学研究所心血管内科研究室。MG132、放线菌酮(cycloheximide,CHX)购自美国ApexBio公司;WWP2质粒购自中国锐博生物公司;anti-HA、anti-GAPDH、anti-p21、二抗试剂购自美国Proteintech公司;anti-WWP2购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养:用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液,在37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养HEK 293T细胞。根据细胞生长状态、生长密度换液、传代。
1.2.2 细胞转染:用PBS缓冲液洗涤待转染的细胞(生长密度约70%),并更换新鲜培养基,用Lipofectamine 3000转染试剂行过表达WWP2质粒转染。室温下孵育15~20 min,缓慢将转染体系吹匀后滴入培养基中并晃匀,置入孵箱继续培养6~8 h后,更换培养液,继续培养至转染后48 h,收取细胞进行后续实验。用PBS缓冲液洗涤待转染的细胞(生长密度约70%),并更换新鲜培养基,用jetPrime转染试剂进行WWP2siRNA转染。室温下孵育15~20 min,缓慢将转染体系吹匀后滴入培养基中并晃匀,置入孵箱继续培养12~24 h,更换培养液,继续培养至转染后72 h,收取细胞进行后续实验。
1.2.3 Western blotting:用蛋白质合成抑制剂CHX(50 μmol/L)或蛋白酶体抑制剂MG132(50 μmol/L)处理过表达或敲减WWP2的293T细胞0、4、8 h后,收集细胞并裂解,4 ℃、13 300 r/s离心20 min,收集蛋白。BCA法行蛋白定量后上样,行SDS电泳,4 ℃、恒流200 mA、120 min将蛋白转至PVDF膜。5%BSA室温封闭1 h。加入一抗(用含有1%BSA的TBST试剂1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次,加入对应的二抗,室温孵育1 h,TBST缓冲液漂洗膜3次。过氧化物酶法显色,用Image J软件测量条带灰度值。GAPDH作内参照。
1.2.4 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验:蛋白制备及定量步骤同Western blotting。在Co-IP蛋白样品中加入1~3 μL相应抗体后,于4 ℃混转3 h后,加入30 μL beads并混匀,4 ℃混转过夜。弃上清,加入1 mL细胞裂解液,4 ℃混转10~15 min,重复3次。加 入25~30 μL 2×Loading Buffer,与input同在沸水中加热7 min,瞬离后备用。后续实验步骤同Western blotting。
1.3 统计学分析
所有图片用Photoshop2019、Adobe Illustrator 2019软件处理后,以GraphPad Prism8作图,并采用SPSS 25.0软件进行统计分析。数据以±s表示,2组间比较采用t检验,多组间比较采用One-way ANOVA分析。P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 WWP2与p21相互作用
通过Co-IP及Western blotting检 测293T细胞中WWP2与p21的结合情况。结果显示,WWP2与p21之间存在结合(图1)。
图1 WWP2与p21相互作用Fig.1 Interaction between WWP2 and p21
2.2 WWP2可调节p21的表达水平
Western blotting结果显示,在293T细胞中过表达WWP2,p21的表达水平明显降低(图2A)。且随着WWP2表达量的增加,p21的表达水平相应降低(图2C)。而敲减WWP2后,p21的表达水平相应增加(图2B)。以上结果说明WWP2可影响p21的表达水平,调控p21的稳定性,提示WWP2可能通过蛋白酶体途径降解p21。
图2 WWP2对p21的表达存在负向影响Fig.2 The expression level of WWP2 gene had a negative effect on the expression of p21
2.3 CHX处理WWP2过表达及敲减细胞系
用CHX处理过表达WWP2的293T细胞0、4、8 h。如图3A所示,随着CHX作用时间延长,对照组和过表达组p21的表达水平均逐渐下降。过表达WWP2使p21的半衰期缩短,表明过表达WWP2可降低p21蛋白的稳定性。用CHX处理敲减WWP2的293T细胞 0、4、8 h。如图3C所示,随着CHX作用时间的延长,对照组和敲减组p21的表达水平均逐渐升高。敲减WWP2使p21的半衰期延长,表明敲减WWP2能增加p21蛋白的稳定性。以上结果提示,WWP2能降低p21的表达水平。
图3 CHX处理WWP2过表达及敲减293T细胞系Fig.3 CHX-treated WWP2 overexpressed or knockdown 293T cell lines
2.4 MG132处理WWP2过表达及敲减细胞系
MG132作用WWP2过表达293T细胞0、4、8 h,用Western blotting检测WWP2、p21和内参GAPDH的表达情况。结果如图4A所示,随着MG132作用时间的延长,对照组和过表达组p21的表达水平均逐渐上升。相对于过表达组,HA-空载组p21蛋白表达在MG132处理后变化更显著。说明WWP2能降低p21的表达水平,MG132可阻断WWP2对p21的负性调控,使内源性p21的累积增加。
MG132作用WWP2敲减293T细胞0、4、8 h,用Western blotting检测WWP2、p21和内参GAPDH的表达情况。结果如图4C所示,随着MG132作用时间的延长,对照组和敲减组p21的表达水平均逐渐上升。相对于未敲减组,敲减组p21蛋白表达在MG132处理后变化更显著。说明WWP2使p21的表达水平下降。
图4 MG132处理WWP2过表达及敲减细胞系Fig.4 MG132-treated WWP2 overexpressed and knockdown cell lines
以上均提示体系中p21的降解依赖于蛋白酶体途径,证实了WWP2通过蛋白酶体途径介导p21的降解。
3 讨论
WWP2可将泛素连接至靶蛋白,并促使蛋白酶体降解靶蛋白[3]。研究表明,泛素化不仅与肿瘤的发病密切相关[4],还与抗癌药物的耐药性相关[16]。近年来,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21在抑瘤功能中的重要性突显,并因此成为研究治疗策略的重点。
WWP2是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的成员之一,该系统是蛋白质降解的主要通路之一,多种蛋白的调节功能与这一系统密切相关。本研究结果发现,WWP2与p21之间存在结合。过表达WWP2使293T细胞p21蛋白表达水平降低,敲减WWP2则使293T细胞p21蛋白表达水平增加,提示WWP2可调节p21的表达水平。
为了进一步确定蛋白酶体途径是否与p21蛋白降解过程有关,本研究应用蛋白质合成抑制剂CHX处理293T细胞,结果发现,对照组与实验组p21表达水平均随CHX作用时间延长而减少;且过表达WWP2后p21的半衰期缩短,敲减WWP2则使p21的半衰期延长。以上均证实WWP2并非在翻译合成的方向调控p21。
为了进一步检测293T细胞中p21的降解情况,本研究应用蛋白酶体抑制剂MG132处理293T细胞。MG132是蛋白酶体特异性抑制剂,主要通过抑制蛋白酶体系统而使相应蛋白在体内积累。结果发现,对照组和实验组p21表达水平均随MG132作用时间延长呈梯度增加。说明体系中p21的降解依赖于蛋白酶体途径。相对于过表达组,HA-空载组在MG132处理后p21变化水平更为明显。相对于未敲减组,敲减组在MG132处理后p21变化水平更为明显。表明WWP2可通过蛋白酶体途径降解p21。
综上所述,本研究首次发现E3泛素连接酶WWP2可通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性。本研究结果有望推动WWP2及泛素化的研究,为疾病的诊疗提供理论依据。