补肾健脾方对高脂饮食诱导肥胖大鼠生殖能力的改善作用

2022-02-04吕雪梅张洋洋宋晓雯刘明妍杜可王玉宝魏敏杰

中国医科大学学报 2022年12期

吕雪梅，张洋洋，宋晓雯，刘明妍，杜可，王玉宝，魏敏杰，

（1.中国医科大学药学院药理学教研室，沈阳 110122；2.辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司研发部，沈阳 110002）

育龄女性肥胖发病率在世界范围内逐年上升，且与女性生殖功能障碍密切相关，研究［1-2］表明肥胖可以增加不孕风险。肥胖会诱发激素综合环境改变，导致下丘脑功能障碍、促性腺激素分泌异常、卵泡发育受损和排卵功能障碍等［3］。医学上治疗生殖障碍疾病往往采用辅助生殖技术或激素替代疗法等方法，但效果并不理想，不良反应明显。

中医认为不孕的病因繁多，肾虚、痰湿、肝郁、血淤均可造成不孕［4］。肾虚为其本，肝脾失调所致气滞、痰湿、血淤为其标，应标本兼治，肝肾脾同调［5］。因此，在中医治疗过程中以整体理论和辨证施治为基础，调节机体气血阴阳，从而提高卵巢功能的效果，具有相对西医诊疗依从性高，不良反应少，无创等优点。本研究旨在探讨补肾健脾方对肥胖大鼠生殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：5～6周龄SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008，饲养于中国医科大学实验动物部，饲养环境为（23±2）℃，相对湿度50%～70%，给予12 h光照，自由摄食饮水，常规适应喂养1周。

1.1.2 药物与试剂：沙棘6 g，枸杞18 g，黑芝麻10 g，黄精12 g，乌梅12 g，大枣18 g，山药23 g，葛根23 g，茯苓18 g，酸枣仁10 g，购自沈阳市大东区长生堂药房。药材制成浓度为1.20 g/mL的提取液。普通饲料（27%粗蛋白、13%粗脂肪、60%碳水化合物）；高脂饲料（20%粗蛋白，45%粗脂肪，35%碳水化合物）购自南京盛民科研动物养殖场；大鼠促卵泡激素（follice-stimulating hormone，FSH）、促黄体激素（luteinizing，LH）、雌二醇（estradiol，E2）激素、抗缪勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）ELISA检测试剂盒（北京诚林生物科技有限公司）；吉姆萨染色液R20649（上海源叶生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器：多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；分析天平（北京赛多科斯科学仪器有限公司）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；石蜡切片机（美国Thermo公司）；倒置显微镜成像显微镜（日本尼康公司）；切片扫描仪（日本滨松公司）；4 ℃高速离心机（上海Heal Force公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组：将雌性大鼠按随机分组方法分为正常饮食组，高脂饮食组，补肾健脾方低、中、高剂量组（分别表示为ND组、HFD组、BSJP-L组、BSJP-M组和BSJP-H组），每组8只。各组大鼠体质量比较差异无统计学意义。ND组和HFD组给予生理盐水灌胃，BSJP-L组，BSJP-M组和BSJP-H组分别按照150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg，1次/d灌胃给药。饲养期间各组均自由饮食并饮清洁水，每周测量体质量。喂养9周后按照高脂喂养大鼠体质量均值高于ND组均值10%的标准［6］确认肥胖模型构建成功。

1.2.2 显微镜下观察肥胖鼠动情周期变化：大鼠动情周期包括动情前期（proestrus，P）、动情期（estrus，E）、动情后期（metestrus，M）、动情间期（diestrus，D）。饮食干预第8周开始每日对大鼠发情周期记录12 d，按照参考文献［7］描述的方法操作。4 d为1个周期，统计每个周期大鼠发情周期的比率。

1.2.3 大鼠受孕及产仔情况观察：饮食干预第10周，按照雌雄2∶1进行合笼。记录大鼠受孕率。孕鼠生产当日记录每只孕鼠产仔数量。

1.2.4 脂肪指数测定：2%戊巴比妥40 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌方法取卵巢并剥离卵巢周围脂肪，称重后记录，记录卵巢周围脂肪指数，脂肪指数=100×脂肪质量（g）/体质量（g）×100%。

1.2.5 大鼠卵巢组织形态学观察：将各组大鼠的左侧卵巢置于4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察卵巢组织形态变化，并记录卵泡数目。

1.2.6 大鼠血清FSH、LH、E2、AMH激素水平检测：大鼠麻醉后，腹主动脉取血室温静置1 h后3 000 r/min离心，立即吸取上清分装于-80 ℃保存。ELISA检测各组大鼠血清中FSH、LH、E2、AMH激素水平，具体操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件对数据进行分析，Graphpad Prism8作图，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以±s表示，多组间差异分析采用单因素方差分析（One-way-ANOVA），均数间两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中药复方对大鼠体质量的影响

高脂饮食喂养9周后，HFD组（313.7 g±15.6 g）相比于ND组（280.4 g±10.9 g）体质量显著增高（P＜0.01），BSJP-L组（286.8 g±5.3 g）、BSJP-M组（289.5 g±12.9 g）、BSJP-H组（286.6 g±20.4 g）相比于HFD组体质量显著降低（P＜ 0.05或＜ 0.01）。卵巢周围脂肪指数HFD组（58.7±4.2）相比于ND 组（37.4±7.0）显著增高（P＜ 0.001），而BSJP-M组和BSJP-H组（43.1±5.8和43.6±6.0）相比于HFD组脂肪指数均显著下降（P＜ 0.01）。见图1。

图1 中药复方对大鼠体质量及脂肪指数的影响（±s，n=8）Fig.1 The effect of the prescription on rat body mass and fat index（±s，n=8）

2.2 阴道涂片观察中药复方对高脂饮食诱导的肥胖大鼠动情周期的影响

通过为期12 d的观察，发现与ND组相比，HFD组E期所占比例明显降低，M/D期所占比例明显升高（P＜ 0.01）。BSJP-M组和BSJP-H组相比于HFD组E期比例明显升高，M/D期所占比例显著降低（P＜0.001或0.05），见表1。P期所占比例各组无统计学差异（均P＞ 0.05）。

表1 各组大鼠动情周期所占比例（±s，%，n=6）Tab.1 The percentage of rats in a particular phase of the estrous cycle in each group（±s，%，n=6）

1）P ＜ 0.000 1，2）P ＜ 0.001 vs ND group；3）P ＜ 0.001，4）P ＜ 0.05 vs HFD group.

2.3 中药复方对高脂饮食诱导的肥胖大鼠受孕率及产仔数量的影响

HFD组（5/8，63%）与ND组（8/8，100%）相比受孕率下降，与HFD组相比各中药复方组（均为8/8，100%）受孕率均有所提升。HFD组（5±3.4）相比于ND组（13±1.6）孕鼠产仔数量显著下降（P＜ 0.01），而与HFD组相比，BSJP-L组（14±2.3），BSJP-M组（13±0.7），BSJP-H组（11±1.3）产仔数量均显著提升（P＜0.05）。

2.4 中药复方对高脂饮食诱导的肥胖大鼠血清性激素的影响

与ND组比较，HFD组大鼠血清FSH、LH水平明显升高（P＜ 0.01），E2、AMH水平明显降低（P＜0.01）；与HFD组比较，不同剂量的中药复方组大鼠血清FSH、LH水平均明显降低（P＜ 0.05或＜ 0.01），BSJP-M组、BSJP-H组的E2、AMH水平均明显升高（P＜0.05或＜ 0.001）。见表2。

表2 中药复方对肥胖大鼠血清性激素的影响（±s，n=8）Tab.2 The effect of the prescription on serum sex hormones in obese rats（±s，n=8）

1）P ＜ 0.001，2）P ＜ 0.01 vs ND group；3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01，5）P ＜ 0.001 vs HFD group.

2.5 中药复方对高脂饮食诱导的肥胖大鼠卵巢组织病理学的影响

ND组大鼠卵巢组织可见各级卵泡，轮廓清晰；HFD组大鼠卵巢组织未见优势卵泡，生长卵泡少见，可见大的闭锁卵泡，中药复方组卵泡发育情况有所恢复，见图2。与ND组（15±1.92）相比，HFD组（6.5±1.73）卵泡总数显著下降（P＜ 0.001），而BSJP-L组（10±2.18）、BSJP-M组（13±1.85）、BSJP-H组（12±1.65）卵泡总数相比于HFD组均显著提升（P＜0.05）。

图2 中药复方对高脂饮食诱导的肥胖大鼠卵巢组织病理学影响 HE×100Fig.2 The effect of the prescription on the ovarian histopathology of HFD-induced obese rats HE×100

3 讨论

肥胖导致不孕的机制包括激素变化、月经紊乱和排卵障碍［8-10］。有研究［11］表明，高脂饮食会损害女性下丘脑-垂体-卵巢轴的功能从而影响生育能力。中医认为女性生殖障碍属于“月经过少，不孕，闭经”等范畴。此类疾病与肾精不足、脾胃虚弱有关。肥胖的原因为水湿积聚，其病因也与肾虚脾虚相关。肾为先天之本，藏精，主生殖；脾为后天之本，生血，主运化。肾气不足，胎元不固，脾气不足，胎失滋养。补肾健脾方除了具有滋阴养血，健脾益气的疗效外，还具有减肥功效。史志萍等［12］研究纳入120例围绝经期及绝经期妇女作为研究对象，发现补肾健脾中药可降低围绝经期及绝经期妇女的体质量指数，提高生殖激素E2水平，降低FSH及LH水平。沈明洁等［13］研究表明补肾健脾方有助于改善自然衰老小鼠的卵子质量，在一定程度上改善自然衰老小鼠的生殖能力。金志春等［14］研究纳入505例复发性流产患者作为研究对象，观察到补肾健脾调和气血中药治疗2个疗程后可以显著提高复发性流产患者的妊娠率以妊娠成功率。因此，探究补肾健脾方对高脂饮食诱导肥胖的生殖功能改善作用具有重要意义。

本研究成功建立肥胖模型，HFD组大鼠E期所占比例显著下降，M/D期比例显著延长，受孕率下降，产仔数量显著下降，生殖激素 FSH和LH显著增高，E2和AMH显著下降，闭锁卵泡增多，卵泡总数显著减少。表明高脂饮食诱导的肥胖，可导致生殖激素水平紊乱，生殖能力下降。经过补肾健脾方治疗后，各剂量组的体质量相比于HFD组均显著下降，表明本组方可改善肥胖大鼠体质量。BSJP-M组和BSJP-H组相比于HFD组E期所占比例延长，M/D期比例显著缩短，生殖激素FSH和LH水平显著下降，E2、AMH水平显著增高，受孕率提升，产仔数量增多，卵巢形态改善，卵泡总数提升。表明本补肾健脾方可以改善肥胖大鼠动情周期紊乱，改善激素水平紊乱，提高生殖能力。

综上所述，本中药复方通过下调性激素FSH及LH水平，上调E2及AMH水平，从而改善肥胖大鼠的生殖能力。