产漆酶真菌筛选、鉴定及酶促去除苯酚的条件优化

岑庆静，万 辉,，刘 薇，李 绪，洪 妮，付桂明，郑洪立,1c，刘玉环,1b，巫小丹,1c*

(1.南昌大学a.生物质转化教育部工程研究中心；b.食品科学与技术国家重点实验室；c.国际食品创新研究院，江西 南昌 330047;2.南昌市检验检测中心农产品检测分中心，江西 南昌 330005)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2，简称Lac)是含铜多酚氧化酶家族的重要成员，能通过分子氧催化氧化多种酚类、芳胺类等物质，且其唯一的催化反应副产物为水，已被公认为环境友好型的绿色催化剂，在纸浆漂白、染料脱色、食品加工和有机污染物处理等领域得到广泛应用[1,2]。随着生物技术的快速发展，众多工业领域对高活性漆酶的需求不断增加，而其生产成本、产量和催化效率成为了影响漆酶产业发展的重要因素。真菌漆酶主要来源于白腐真菌，如糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)[3]、云芝(Trametesversicolor)[4]、血红密孔菌(Pycnoporuscoccineus)[5]、毛栓菌(Trameteshirsuta)[6]和粗毛革孔菌(Coriolopsisgallica)[7]等。然而，不同菌株的产酶能力存在差异，且自然条件下真菌产漆酶水平有限，难以满足工业化生产的需求。研究表明，芳香化合物和金属离子是白腐真菌表达漆酶的有效诱导剂，它们可通过上调漆酶基因的转录水平提高真菌漆酶的表达量[8,9]。在金属离子中，铜离子对漆酶表达的促进作用最为显著[10,11]。此外，芳香化合物与金属离子之间还可能存在协同诱导作用，但不同诱导剂的复合影响存在差异[8]。选育高产漆酶菌株并优化其产酶诱导条件，仍然是目前提高真菌漆酶生产水平的重要手段。

苯酚及其衍生物广泛存在于化工、炼油、造纸、制药等工业废水中[12]，由于其毒性风险高、难去除，已成为环保部门重点关注的环境污染物。此外，苯酚也是饮用水中严格监测的污染物，国家标准《生活饮用水卫生标准》GB5749—2006规定饮用水中的挥发酚类(以苯酚计)含量的限值为0.002 mg·L-1。为了控制酚类有毒物质带来的污染风险，蒸馏、萃取、膜处理、吸附、光催化、高级氧化技术等多种方法被广泛研究，相比而言，近年来新兴的酶催化法(特别是漆酶和过氧化物酶)具有环境友好、条件温和、高效和低成本等优点，成为处理酚类污染物的重要技术[12-13]。已有研究表明，漆酶对酚类、芳胺类等顽固性有机污染物具有良好的催化效果，催化形成不溶性的聚合物，可采用过滤等方法将其从废水中除去，实现水质净化[14-15]。由于漆酶的催化效率与漆酶来源和催化条件(如温度和pH等)等诸多因素息息相关，探究这些因素对实现酚类污染物的高效去除具有重要意义。

本研究从自然环境中分离到一株高产漆酶的粗毛革孔菌(C.gallica)NCULAC F1，探究了其生产漆酶的诱导条件，并将其所产漆酶应用于苯酚去除，进一步优化作用条件，以实现苯酚高效去除。目前应用于酚类污染物处理的白腐菌漆酶多来源于云芝(T.versicolor)，而粗毛革孔菌漆酶的应用鲜有报道。本研究发现粗毛革孔菌NCULAC F1产漆酶能力较强，其产酶能力是糙皮侧耳(一种广泛报道的高产漆酶真菌)的1.78倍，且其漆酶对苯酚具有很好的去除效果，研究结果可为处理酚类污染物的优质真菌漆酶资源开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

糙皮侧耳(P.ostreatus)为实验室保藏菌种，野生菌株来源于自然样本：1号自然样本采集于南昌大学校内苗圃园腐木，2号自然样本采集于广西贵港陈年稻草垛堆底土壤。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养基：26.0 g马铃薯葡萄糖水，20.0 g琼脂粉，蒸馏水1.0 L，pH自然。以添加0.04%愈创木酚(Guaiacol)的PDA培养基为初筛培养基(G-PDA)，以添加0.04%愈创木酚的马铃薯葡萄糖水培养基(Potato dextrose broth,PDB)为复筛培养基(G-PDD)。初始产酶培养基：柚皮粉8.3 g,麸皮16.7 g，磷酸二氢钾3.0 g，硫酸镁1.5 g，氯化钙0.5 g，蒸馏水1.0 L，调节pH至5.0。每个250 mL锥形瓶分装100 mL培养基，于121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

马铃薯葡萄糖水购自青岛海博生物技术有限公司；2’2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS，98%)、愈创木酚(99%)和苯酚(99%)购自上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

全温摇床(HZQ-B)金坛市圣威实验仪器厂；可见分光光度计(UV-9000)上海元析仪器有限公司；酶标仪(FlexA-200)杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产漆酶菌株的筛选

糙皮侧耳菌是典型的产漆酶真菌，本研究以实验室保藏的糙皮侧耳菌株为对照，评估筛选菌株的产漆酶水平。菌株筛选包括平板初筛和摇瓶复筛两个步骤，具体如下：

初筛：将采集的腐木和土壤样本在无菌环境中打碎，分别接入到装有5颗小玻璃珠和适量无菌水的三角瓶中，摇床振荡20 min，用无菌水将混合液稀释至10-1，10-2和10-3等系列浓度。分别取100 μL各梯度稀释液涂布于初筛平板上，28 ℃培养，挑取产生红褐色氧化带的菌落进行重复分离纯化，直至获得纯菌落。将纯菌落接种至PDA斜面培养基，经培养后于4 ℃保藏。

复筛：采用摇瓶复筛进一步确定菌株的产酶能力，挑取适量菌丝接种至装有复筛培养基的锥形瓶中，于28 ℃±2 ℃，120 r·min-1摇瓶培养14 d，每天取样测定漆酶活力。

漆酶活力测定：参考Xu等人[7]的方法，以ABTS为底物，构建3 mL反应体系，包括2 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)，0.1 mL酶液和0.9 mL 1 mmol·L-1ABTS。在25 ℃条件下，测定反应前3 min内OD420的增加量，每分钟氧化1 μmol ABTS所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.3.2 高产漆酶菌株的鉴定

将高产漆酶菌株接种至PDA平板，于28 ℃培养7 d，观察菌落的外观形态和菌丝的显微形态特征。利用真菌18S rDNA通用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)进行PCR扩增，基因提取和测序等工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将测序结果提交至NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，进行BLAST比对分析，获取相似序列，采用MEGA 6软件通过Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树。

1.3.3 真菌漆酶协同诱导表达研究

种子液的制备：将菌种从保藏斜面上转接至PDA平板，在恒温培养箱中28 ℃培养至菌丝长满平板，用无菌打孔器从菌落边缘取3个菌饼(10 mm)，接种至装有100 mL液体PDA培养基和1颗搅拌子的锥形瓶中，于28 ℃±2 ℃、120 r·min-1振荡培养5 d，用磁力搅拌器将菌丝球打散，制成菌丝悬浮液。

诱导产酶：参考Zhuo等人[8]的方法，在初始产酶培养基中分别添加终浓度为0.2 mmol·L-1的芳香化合物(丁香酸、丁香醛、香豆酸、香草醛、对羟基苯甲醛、ABTS、阿魏酸、愈创木酚和2,6-二甲基苯酚)，按照3%的接种量将种子液接种至培养基中，在28 ℃±2 ℃，120 r·min-1条件下，摇瓶培养6 d，于3，4，5，6 d取发酵液1 mL，测定漆酶活力，探究芳香化合物的诱导作用。在此基础上，选择较优的芳香化合物(0.2 mmol·L-1)进一步探究其与CuSO4(1.0 mmol·L-1)的协同诱导作用。对照组不添加任何化学诱导剂。每个处理重复3次实验。

1.3.4 漆酶去除苯酚的特性研究

漆酶的提纯：收集最佳诱导条件下的发酵液，参考邹佩[16]的方法，采用90%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-FF阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析等步骤从发酵液中提纯漆酶，漆酶的比活力由30.78 U·mg-1提高至188.79 U·mg-1。将提纯的漆酶进行冷冻干燥，用超纯水将漆酶冻干粉配制成80 U·mL-1漆酶液，用于后续试验。

漆酶催化苯酚实验：准确称量50 mg苯酚晶体，用超纯水定容至100 mL，配制成500 mg·L-1的苯酚溶液。建立10 mL反应体系：8 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)，1 mL漆酶溶液(加酶量为8 U·mL-1)和1 mL苯酚溶液(终浓度为50 mg·L-1)。设定苯酚初始浓度范围为10～60 mg·L-1，酶促反应在50 ℃、150 r·min-1水浴摇床中进行，在0.25，0.5，1，2，4，6 h取样测定苯酚的去除率。进一步地，采用单因素优化实验探究温度(30 ℃～90 ℃)、体系pH(2.0～7.0)、加酶量(0～25 U·mL-1)和ABTS介体浓度(0～0.6 mmol·L-1)等条件对漆酶去除苯酚的影响。苯酚去除率的计算公式为：R(%)=(C0-C)/C0×100%，其中，R为苯酚去除率，C0为苯酚初始浓度，C为苯酚剩余浓度。

苯酚浓度的测定：参考Wood等人[17]的方法，并略有改动。取40 μL样品溶液加入160 μL磷酸盐缓冲液中(0.1 mol·L-1，pH 8.0)，随后加入2 μL 4-氨基安替比林(0.1 mol·L-1)溶液，混匀，再加入2 μL铁氰化钾(0.2 mol·L-1)溶液，在25 ℃下振匀15 min，利用酶标仪测定500 nm处的吸光度，根据标准曲线计算苯酚浓度。

1.4 数据处理

采用软件Excel 2016和SPSS 26.0对实验数据进行处理和单因素方差分析，结果以3次重复实验数据的平均值±标准偏差形式表示。采用软件Origin 2018绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 高产漆酶菌株的筛选及鉴定

在G-PDA筛选平板中，菌株分泌胞外漆酶氧化愈创木酚生成红褐色的醌类物质，因此可根据显色反应高效地筛选出产漆酶菌株[18]。本研究采用平板显色法共分离到3株产漆酶真菌，其中，菌株NCULAC F1筛自腐木(1号自然样本)，菌株NCULAC F2和F3筛自土壤(2号自然样本)。根据表1的初筛结果，筛选平板颜色的深浅为：NCULAC F1>糙皮侧耳>NCULAC F3>NCULAC F2，初步判断NCULAC F1和糙皮侧耳的产漆酶能力较强。NCULAC F1在G-PDA筛选平板上形成深红褐色的氧化圈，其菌落在PDA平板上呈白色细绒毛状，与培养基结合较牢固，菌丝透明，有横隔(图1)。由表1的摇瓶复筛结果可知，NCULAC F1的产漆酶能力最强，其漆酶活力达(0.73±0.02) U·mL-1，显著高于糙皮侧耳、NCULAC F2和NCULAC F3所产漆酶的活力(P<0.05)。因此，选择产漆酶潜力较强的NCULAC F1菌株进行后续研究。

表1 产漆酶菌株的平板初筛和摇瓶复筛结果Tab.1 Results of initial screening on plate and re-screening in shake flask of laccase producing strains

图1 NCULAC F1在G-PDA筛选平板上形成的红褐色氧化圈(a为平板正面、b为平板背面)、PDA平板上的菌落形态(c)、光学显微镜下的菌丝形态(d)Fig.1 Red-brown oxidation circle formed by NCULAC F1 on G-PDA screening plate (a is the front side of the plate,b is the back side of the plate),colony morphology on PDA plate (c),mycelial morphology under optical microscope (d)

测序结果表明，NCULAC F1菌株的18S rDNA序列片段大小为1318 bp，其序列被提交至GenBank数据库(No.MW736896.1)。BLAST同源比对结果显示，NCULAC F1菌株与粗毛革孔菌C.gallicaHTC(GenBank：KP262346.1)的同源性最高，并在系统发育树(图2)中与C.gallicaHTC、Coriolopsissp.M3 ZM-2012和C.gallicaRLG 7630-SP具有较强的亲缘性。该菌株被鉴定为粗毛革孔菌，命名为粗毛革孔菌NCULAC F1，保藏至中国典型培养物保藏中心(CCTCC No.M2021731)。

2.2 粗毛革孔菌漆酶协同诱导表达研究

9种芳香化合物对粗毛革孔菌NCULAC F1产漆酶的影响如图3所示，在摇瓶发酵4 d后，各组均达到产酶高峰，而后酶活力逐渐下降，但不同诱导剂对NCULAC F1漆酶活力的影响存在较大差异。在不添加任何诱导剂的对照组中，最大漆酶活力为3.00 U·mL-1，而添加了2,6-二甲基苯酚和对羟基苯甲醛后，获得的最大漆酶活力分别达到3.87和3.70 U·mL-1，分别是对照组的1.29和1.23倍。这一结果表明2,6-二甲基苯酚和对羟基苯甲醛对漆酶的诱导表达具有积极的影响，但这种诱导作用并不显著(P>0.05)。另外，丁香酸、丁香醛、香豆酸、香草醛、ABTS和阿魏酸等的诱导效果不明显，甚至出现了轻微的抑制作用。这种抑制效果可能是由于芳香化合物对菌丝生长的毒害作用大于其对漆酶表达的诱导作用。因为芳香诱导剂本身具有一定的毒性，真菌分泌漆酶是其自身的一种防御机制：通过释放胞外漆酶去降解毒性物质，从而减少不良环境的威胁[19,20]。Souza等人[21]发现肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)漆酶的最佳芳香诱导剂是阿魏酸和香草醛；而Valle等人[22]发现姬松茸(Agaricusblazei)漆酶的最佳芳香诱导剂是愈创木酚和香草醛。最适诱导剂的差异可能与菌株的来源、对芳香化合物的毒性耐受性及培养环境有关。根据本研究的结果，2,6-二甲基苯酚和对羟基苯甲醛是较适合粗毛革孔菌产漆酶的诱导剂，因此选择这两种诱导剂进一步探讨其与铜离子的协同作用。

图2 NCULAC F1菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of NCULAC F1 strain

t/d注：不同小写字母表示不同芳香化合物对漆酶的诱导作用之间存在显著性差异(P<0.05)；选择诱导作用较强的两种芳香化合物进行显著性分析。图3 不同芳香化合物对粗毛革孔菌表达漆酶的影响Fig.3 Effects of different aromatic compounds on the expression of laccase from C.gallica

铜离子是漆酶分子结构的活性中心，众多研究已证明添加铜离子可以显著增强真菌漆酶的表达水平[10,11]。图4是硫酸铜单独诱导及其分别与两种芳香化合物复合诱导下的产酶效果。硫酸铜的诱导作用比2,6-二甲基苯酚和对羟基苯甲醛的诱导作用更显著(P<0.05)，发酵4 d后，硫酸铜诱导下的漆酶活力(6.82 U·mL-1)分别是对照组的1.44倍、2,6-二甲基苯酚诱导下的1.20倍和对羟基苯甲醛诱导下的1.49倍。此外，该酶活力也高于Sadhasivam等人[23]报道的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)在1 mmol·L-1CuSO4诱导下的漆酶活力(4.36 U·mL-1)。Cu2+对漆酶表达的强烈诱导效果可能与其在漆酶基因转录中不可或缺的作用有关[24]。将硫酸铜与芳香化合物同时添加到培养基后，发现硫酸铜与2-6-二甲基苯酚对粗毛革孔菌漆酶的表达具有显著的协同诱导效果(P<0.05)，其最大酶活力在摇瓶发酵5 d达到11.29 U·mL-1，比对照组、单一2-6-二甲基苯酚和单一硫酸铜诱导下的酶活分别提高了138.69%，98.14%和65.66%。相比之下，铜离子与对羟基苯甲醛的协同诱导作用不显著(P>0.05)，培养4 d的最大酶活力仅为5.94 U·mL-1。

t/d注：不同小写字母表示不同诱导剂组合对漆酶的诱导作用之间存在显著性差异(P<0.05)。图4 芳香化合物与硫酸铜对粗毛革孔菌漆酶表达的协同诱导作用Fig.4 Synergistic inducing effect of aromatic compounds and copper sulfate on laccase expression of C.gallica

2.3 粗毛革孔菌漆酶去除苯酚特性

2.3.1 漆酶催化苯酚动力学研究

为探究粗毛革孔菌漆酶对苯酚的去除效果，以苯酚去除率为考察指标，在50 ℃、pH 4.5条件下，采用经提纯制备的漆酶液(8 U·mL-1)催化不同浓度苯酚(10～60 mg·L-1)。从图5可看出，在酶促反应初始的1 h内，苯酚的去除率随着时间的增加而快速上升，并且低浓度苯酚的去除率明显大于高浓度苯酚，1 h时10 mg·L-1和20 mg·L-1苯酚的去除率分别达96.17%和94.45%，而30～60 mg·L-1苯酚的去除率只有83%～88%。在6 h后，10～60 mg·L-1苯酚的去除率均达到95%以上，这表明漆酶的催化能力较强，即使在相对高的底物浓度下，也能达到较好的去除效果。本实验结果比Liu等人[25]利用云芝漆酶去除苯酚的效果(12 h内的苯酚去除率为78%)更佳。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法确定该酶促反应的Michaelis-Menten动力学参数，计算得米氏常数(km)为52.45 mg·L-1，最大反应速率(Vmax)为181.82 mg·L-1·h-1(图6)。Lineweaver-Burk方程的线性拟合度较好，R2为0.9843，表明粗毛革孔菌漆酶催化去除苯酚的过程遵循Michaelis-Menten动力学模型。

t/h图5 漆酶对系列浓度苯酚的去除效果Fig.5 Removal effect of phenol with series concentrations by laccase

2.3.2 温度和pH对漆酶催化苯酚的影响

由上述漆酶对系列浓度苯酚的去除效果(图5)可知，去除过程主要发生在催化反应的前1 h内，为探究不同催化条件对苯酚去除作用的影响，选择0.5和1.0 h两个作用时间点进行考察。温度和pH是酶发挥催化作用的关键因素，在一系列温度(30 ℃～90 ℃)和pH(2.0～7.0)条件下，研究了漆酶对50 mg·L-1苯酚的去除效果。如图7所示，在30～70 ℃范围内，苯酚去除率随着温度升高而逐渐增加，并在70 ℃条件下达到最大值，在1.0 h时的去除率达92.82%，显著高于60 ℃和80 ℃下的去除率(P<0.05)。当温度升至90 ℃，苯酚去除率显著下降(P<0.05)，在0.5 h时仅为35.96%，而当时间延长至1.0 h时，去除率仅增加了10.98%，说明高温导致漆酶发生了热失活。Songulashvili等人[26]发现粗毛革孔菌(C.gallica1184)漆酶的活性在70 ℃下最高，与本研究获得的最佳催化温度一致。漆酶在50 ℃～80 ℃范围内对苯酚均具有较好的催化效果，表明粗毛革孔菌漆酶具有良好的耐热性，可适应工业催化的中高温环境。

S-1/(mg·L-1)图6 漆酶去除苯酚的酶促动力学模型Fig.6 Enzymatic kinetic model of phenol removal by laccase

T/℃注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。图7 温度对漆酶去除苯酚的影响Fig.7 Effect of temperature on phenol removal by laccase

真菌漆酶多为酸性蛋白，一般在偏酸性范围内具有较高的活性[27]。因此，在酸性范围内(pH 2.0～7.0)探究了不同pH对粗毛革孔菌漆酶去除苯酚的影响，结果如图8所示。在pH 2.0～4.0范围内，苯酚的去除效果不理想，0.5 h时去除率均低于30%。特别是在pH 2.0条件下，苯酚的去除率在0.5和1.0 h分别仅为16.85%和18.40%，说明低pH易引起漆酶失活，导致酶促反应受到抑制。而在pH 4.5～6.0范围内，漆酶对苯酚的去除效果随着pH的增加而显著提升(P<0.05)，1.0 h时苯酚去除率均超过80%。其中，苯酚去除率在pH 6.0条件下获得最高，1.0 h时达到97.37%。当pH继续增至7.0时，苯酚去除率下降至82.02%。本研究的结果表明，粗毛革孔菌漆酶在弱酸环境中(pH 4.5～6.5)对苯酚的催化效果较高，最适pH是6.0。刘红艳等人[28]发现，在pH 5.5～7.0的范围内，云芝漆酶对己烯雌酚的催化效果较好，且在pH 6.0时效果最好，与本实验结果相似。

pH注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。图8 pH对漆酶去除苯酚的影响Fig.8 Effect of pH on phenol removal by laccase

2.3.3 加酶量对漆酶催化苯酚的影响

当环境因素和底物浓度一定时，酶促反应速率取决于酶的浓度。在最佳酶促温度70 ℃和pH 6.0的条件下，进一步研究了漆酶加酶量(0，1，2.5，5，10，20，25 U·mL-1)对50 mg·L-1苯酚去除效果的影响，结果如图9所示。当反应体系中未添加漆酶(即加酶量为0 U·mL-1)时，苯酚浓度无变化，表明苯酚的去除是由漆酶催化导致的。当漆酶加酶量由1 U·mL-1增加到5 U·mL-1时，苯酚去除率显著增加(P<0.05)，0.5 h时，5 U·mL-1漆酶对苯酚的去除率即达到93.19%，分别是1 U·mL-1和2.5 U·mL-1漆酶处理下的1.96倍和1.23倍。当漆酶加酶量从5 U·mL-1继续增加至25 U·mL-1时，苯酚去除率未随着加酶量增大而明显提高(P>0.05)，表明5 U·mL-1是漆酶催化50 mg·L-1苯酚的最优加酶量。在相似的实验条件下，Tarasi等人[29]采用5 U·mL-1云芝漆酶处理苯酚40 min，苯酚去除率也仅达到52%。与之相比，本研究中的粗毛革孔菌漆酶对苯酚的去除效果较好，表明其具有较强的催化效率和应用潜力。

加酶量/(U·mL-1)注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。图9 漆酶加酶量对苯酚去除的影响Fig.9 Effect of laccase dosage on phenol removal

2.3.4 介体对漆酶催化苯酚的影响

由于漆酶的氧化还原电位较低，难以催化氧化还原电位较高的底物，为了提高漆酶的催化效果，常常在反应体系中添加一些小分子介体物质，这些氧化还原介体可起类似“桥梁”的作用，促进酶与底物之间的电子转移，从而提高酶促反应效率[30]。根据最新的报道[31,32]，漆酶介体系统(LMS)的显著效果已在处理抗生素、染料等多种难去除污染物的研究中得到证实。LMS作用效果与介体类型和浓度有关，刘红艳等人[28]发现在5种介体中，ABTS对漆酶去除己烯雌酚的作用效果最好，且经优化设计后，获得最佳ABTS作用浓度为1.52 mmol·L-1。为了提高漆酶催化苯酚的效果，本研究选择应用最广泛的ABTS作为酶促反应的介体，在最佳催化条件下，研究不同ABTS浓度(0～0.6 mmol·L-1)对漆酶去除苯酚的影响。从图10中可看出，随着ABTS浓度提高，在反应10 min内，漆酶对苯酚的催化效率显著提升(P<0.05)。在0.6 mmol·L-1ABTS的协助下，苯酚去除率在2.5 min内约为95%，在10 min内达到100%，而对照组(0 mmol·L-1ABTS)在10 min时苯酚去除率仅为58.54%。周鑫等人[33]也发现ABTS可显著提高毛栓菌27～1漆酶对丁香酸的催化效果。这些结果表明ABTS介体对漆酶催化作用的影响在一定浓度范围内具有明显的浓度依赖性。

t/min注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。图10 ABTS对漆酶去除苯酚的影响Fig.10 Effect of ABTS on phenol removal by laccase

3 结论

本研究从自然样本中筛选到一株高产漆酶的白腐真菌NCULAC F1，经鉴定为粗毛革孔菌(C.gallica)。粗毛革孔菌生产漆酶的最佳诱导剂组合为2,6-二甲基苯酚和硫酸铜，在协同诱导条件下，摇瓶发酵5 d漆酶活力达到11.29 U·mL-1，比对照组的漆酶活力提高了138.69%。粗毛革孔菌漆酶去除苯酚的过程遵循Michaelis-Menten模型，其动力学参数km和Vmax分别为52.45 mg·L-1和181.82 mg·L-1·h-1。苯酚去除效果与催化温度、pH、加酶量和介体浓度等因素有关，最佳催化条件为：温度70 ℃，pH 6.0，加酶量5 U·mL-1，ABTS介体浓度0.6 mmol·L-1，在此条件下，在10 min内苯酚去除率达100%。本研究的结果表明，粗毛革孔菌漆酶对水溶液中的苯酚具有良好的去除效果。这一研究初步探明了粗毛革孔菌来源的漆酶催化特性及其应用潜力，为促进利用真菌漆酶高效处理含酚类有机物工业废水提供理论参考。