新型冠状病毒核酸检测弱阳性质控失控分析及影响因素*

李育敏，付晓歌，郭东月，龚海娜，曾子朗，姚洁仪，邓巧梅，李双，张秀明

(深圳市罗湖医院集团医学检验实验室 & 深圳大学第三附属医院检验科，广东深圳 518001)

新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)疫情在世界范围内持续流行，引发疫情的新型冠状病毒(新冠病毒，2019-nCoV)基因组不断变异，影响病毒的生物学特性。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第九版)，新冠病毒核酸检测阳性为确诊的首要标准[1]。各医疗机构应当加强核酸检测的质量控制，确保检测结果准确可靠。按照《新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》要求[2]，实验室应开展室内质控，每批检测至少有1份弱阳性质控品(第三方质控品，通常为检出限的1.5～3倍)、3份阴性质控品(生理盐水)，质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。在新冠病毒核酸检测过程中，第三方弱阳性质控一旦出现失控，将会影响结果的准确判读。目前针对核酸检测失控现象分析的报道较少。本实验室严格按照国家文件规定每批检测至少1份弱阳性质控(广州邦德盛公司)，现就实际工作中发现的弱阳性质控失控案例进行总结分析，探讨相关影响因素和解决措施，供临床参考。

1 案例分析

1.1室内质控失控案例1 当天发现多批次弱阳性质控ORF1ab基因无Ct值或Ct值增高现象(图1A)。针对失控可能发生的原因，实验室逐一排查。(1)核酸提取或扩增：实验室采用的核酸提取试剂为重庆中元汇吉核酸提取试剂盒(磁珠法)，扩增试剂为上海伯杰公司新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。当天失控批次的所有样本检测内标正常，表明核酸提取和扩增过程正常。(2)质控品：更换另一厂家扩增试剂检测弱阳性质控，结果符合预期值(图1B)，排除质控品质量问题。(3)试剂：当天部分批次同时检测弱阳性质控和试剂盒自带的阳性对照，ORF1ab均无Ct值或Ct值增高(图1C)，而另外部分批次试剂盒自带的阳性对照ORF1ab和N的Ct值虽然接近预期值，但其荧光强度(Rn)仍低于前一天未失控批次自带的阳性对照。结合第三方弱阳性质控和自带阳性对照均出现失控的现象，考虑为检测试剂出问题的可能性大，更换同一厂家新批号试剂后，检测弱阳性质控Ct值符合预期值(图1D)，表明失控为试剂质量问题所致。进一步调查也证实失控是发生在当天更换新批号试剂后，更换前检测室内质控均符合预期值。厂商反馈为提高检测灵敏度，对该批号试剂进行了优化(具体环节不详)，考虑可能为优化后反应体系如ORF1ab荧光探针等发生变化或其他干扰因素所致。

1.2室内质控失控案例2 连续2天多批次弱阳性质控ORF1ab的Ct值出现增高现象(图2A)，质控品均为同一批号，失控批次的样本内标检测正常，试剂盒自带的阳性对照ORF1ab和N的Ct值及Rn均正常(图2B)，考虑为该批号质控品出问题的可能性大。更换新批号质控品后ORF1ab Ct值检测正常(图2C)，表明失控为该批号的质控品自身质量问题所致。

1.3室内质控失控案例3 当天下午连续几批弱阳性质控ORF1ab的Ct值出现明显增高现象(图3A-B)，质控品批号和扩增试剂批号均与前一天和当天上午相同，重新提取该批号质控品后检测ORF1ab的Ct值仍增高，更换新批号质控品，用同一种扩增试剂同时检测新、旧批号质控，新批号质控ORF1ab的Ct值明显低于旧批号(图3C)，表明为旧批号质控品问题所致，但是同一旧批号质控品前后结果出现明显差异，考虑可能为质控品反复冻融或储存不当发生了降解。继续查看前后2天的结果，发现当天上午检测试剂盒自带的阳性对照Ct值虽接近预期值，但荧光强度较前一天偏低，而且更换新批号质控品后，ORF1ab Ct值虽明显低于旧批号，但仍高于前一天，且荧光强度也较前一天弱，表明扩增试剂也存在问题。质控品和试剂两者均出现问题，因此考虑存储不当的可能性大，而实验室未发生断电现象，考虑为冰箱门未封闭严密导致的温度不达标。将扩增试剂和质控品均更换后，检测弱阳性质控结果Ct值恢复至前一天预期值水平。采用新更换的试剂同时检测新、旧质控品，旧质控较新质控的ORF1ab Ct值更高，表明除储存原因外，旧质控品还存在多次使用、反复冻融的问题。

注：黄色，内标；绿色，N基因；蓝色，ORF1ab基因。图1 室内质控失控案例1

注：黄色，内标；绿色，N基因；蓝色，ORF1ab基因。图2 室内质控失控案例2

注：黄色，内标；绿色，N基因；蓝色，ORF1ab基因。图3 室内质控失控案例3

1.4室内质控失控案例4 将中值质控品(参考浓度：1.6×104copies/mL)稀释20倍至800 copies/mL作为弱阳性质控(检出限500 copies/mL)，稀释初期检测结果符合预期值，但是后续逐渐出现部分批次弱阳性质控ORF1ab Ct值增高现象，检测批次的Ct值强弱不等，重复性较差。而检测质控品原液(未稀释)的Ct值符合预期值，且重复性较好，表明稀释对质控品的保存有一定影响，稀释后质控品存在降解和不稳定现象。

2 讨论

按照《新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》要求[2]，实验室开展室内质控，弱阳性质控需采用第三方质控品。目前，厂商制备的新冠病毒核酸检测第三方质控品以假病毒为原料，使用较为广泛的有广州邦德盛、北京康彻思坦等生物技术公司生产的室内质控品。相比试剂盒自带的强阳性对照，采用第三方弱阳性质控品的优势在于不针对于特定检测系统和试剂进行优化，具有广泛的通用性，可更为客观地评估检测系统和反映误差水平，更好地监控不同厂家的试剂检测弱阳性样本的灵敏度，避免病毒拷贝数较低时，因检测系统的灵敏度低导致弱阳性样本漏检，出现假阴性；其次阳性质控的浓度越低，核酸污染的风险越小。3份阴性质控品参与从提取到扩增的步骤，可有效监测核酸检测的全流程是否存在污染，也可以将其中1份生理盐水暴露在生物安全柜内，直接加入到检测试剂中监测生物安全柜是否存在气溶胶污染。3份阴性质控检测结果均为阴性，弱阳性质控为阳性，且Ct值符合预期值，视为室内质控在控，否则为失控。

核酸提取及扩增过程、试剂和质控品质量等出现问题均可引起失控。一般情况下，如样本内标检测正常，核酸提取和扩增步骤出问题的可能性较小，那么发生失控首先考虑试剂或质控品的问题。本研究分析的失控案例1和案例2分别由试剂和质控品问题所致，而失控案例3分析原因后考虑为储存不当所致的试剂和质控品均出现问题，将扩增试剂和质控品均更换后，检测弱阳性质控结果正常。因此，建议每批次同时检测2份弱阳性对照，1份为第三方质控品，1份为试剂盒自带的阳性对照稀释至检出限的1.5～3倍(Ct值与第三方弱阳性质控品接近)，以便发生失控时能够及时查找原因，采取纠正措施。另外检测试剂配制好后应避光保存，并尽快使用，更换新批号试剂后，应按文件规定验证试剂批间差异和关键耗材抑制物[3]。

除以上原因外，质控品的正确保存也是影响检测结果的重要因素之一。本研究分析的失控案例3由于储存原因所致保存温度不达标，案例4由于将质控品原液稀释后影响了保存稳定性。邦德盛液体质控品首先对新冠假病毒(含ORF1ab、N、E和M基因)进行构建和培养，获得培养液，对收获的假病毒培养液进行初步定值，然后用阴性稀释液稀释至所需浓度，并添加了适量的稳定剂。如实验室因检测弱阳性质控的浓度要求，进行再次稀释时采用的稀释液或稀释后储存的耗材含RNase或抑制物等都可能影响质控品的稳定性，因此建议直接使用适合参考浓度(检出限的1.5～3倍)的质控品原液进行检测，如邦德盛液体质控品低值(参考浓度：1.4×103copies/mL)，避免因稀释造成的质控不稳定现象。另外质控品原液及其提取后的核酸应严格按照说明书进行保存和使用，不可反复冻融或长时间存放于室温及2～4 ℃，避免质控品降解或变质。

在临床新冠病毒核酸检测过程中经常会观察到N基因和ORFlab基因的检出率存在差异，N基因的阳性率通常高于ORF1ab基因，检出的Ct值大于ORF1ab基因，这可能跟以下因素有关[4-10]：(1)ORF1ab基因特异性强，而N基因相对保守，易与其他病毒发生交叉反应；(2)新冠病毒转录新的mRNA均带有N基因，而ORF1ab基因拷贝数较低；(3)2个基因序列不同，不同厂家的试剂设计对ORF1ab基因和N基因的检测灵敏度存在差异等。同样第三方弱阳性质控品失控也常首先观察到ORF1ab基因Ct值增高或检测不出，而N基因可检出。由于第三方质控品非临床样本，其原因主要与试剂的灵敏度有关。

综上所述，新冠病毒核酸检测出现弱阳性质控失控，要从核酸提取、扩增和检测结果全流程进行追溯分析，并结合试剂和质控品综合判断失控原因及影响因素，及时采取相应的纠正措施，确保检测结果准确可靠。