流式微球阵列法检测Th1/Th2细胞因子谱在细菌性血流感染中的临床应用*

刘玉鑫,韩迎香,包爱玲,王雅菲,袁向珍,托娅

(1.内蒙古医科大学，呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院a.检验科，b.体检中心，呼和浩特 010050)

细菌性血流感染诊断的金标准是血培养，但由于培养周期长、结果阳性率低等原因，不利于急性感染的诊断和治疗。目前感染相关的常规检测指标包括外周血白细胞计数(white blood cell count，WBC)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、红细胞沉降率和降钙素原(procalcitonin，PCT)等，但对细菌感染诊断普遍没有较好的敏感性和特异性。Th1/Th2是辅助性T淋巴细胞亚群，分泌的多种细胞因子发挥协同效应，促使机体免疫环境维持在健康的平衡状态。近年来，逐渐关注其在评估机体感染严重程度方面的潜在价值。本研究主要基于流式微球阵列技术(cytometric bead array，CBA)检测感染状态下Th1/Th2细胞因子谱的变化，探讨革兰阳性/革兰阴性(G+/G-)血流感染的类型与不同实验室生物标志物的关系，旨在为临床诊断和治疗血流感染提供有利的参考依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 纳入2019年9月—2021年8月内蒙古医科大学附属医院住院患者中细菌性血流感染89例。纳入标准：(1)年龄≥18周岁；(2)细菌血培养阳性患者。排除标准：(1)血培养样本受污染；(2)真菌、病毒、支原体感染；(3)合并免疫系统疾病；(4)研究资料不完整。根据感染类型，分为G+菌感染组46例、G-菌感染组43例。G+菌感染组男性33例，女性13例，年龄(59.07±13.53)岁;G-菌感染组男性21例，女性22例，年龄(63.09±12.92)岁。另择同期体检健康者31例纳入健康人对照组，男性21例，女性10例，年龄(58.26±15.65)岁。各组性别和年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会批准(批准文号：WZ2022049)。

1.2仪器与试剂 FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)，人Th1/Th2亚群检测试剂盒(江西赛基公司)；mindray CAL-8000全自动血细胞分析仪和配套检测试剂(深圳迈瑞公司)；Aristo轨道式全自动特定蛋白分析仪和配套CRP检测试剂(深圳国赛公司)；UniCel Dxl 800全自动化学发光免疫分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，PCT检测试剂盒(四川沃文特公司)。

1.3Th1/Th2细胞因子谱测定 基于流式CBA技术，测定血清样本的细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量，检测上、下限分别为2.5 pg/mL和2 500 pg/mL，参考区间上限分别为5.71、2.80、5.30、4.91、2.31和7.42 pg/mL。

1.4WBC测定 按试剂说明书操作。WBC参考区间为3.5×109/L～9.5×109/L。

1.5CRP测定 基于免疫散射比浊法，按试剂说明书操作。参考区间为0～5 mg/L。

1.6PCT测定 基于磁微粒和化学发光技术，按夹心法原理进行免疫检测，按试剂说明书操作，通过浓度—相对发光值的校准曲线，计算PCT浓度。检测下限为0.02 μg/L，参考区间上限为0.05 μg/L。

2 结果

2.1细菌性血流感染患者病原菌种类分布 血培养共检出病原菌89株，其中G+菌占51.69%，G-菌占48.31%。G+细菌主要为链球菌9株(10.11%)、人葡萄球菌人亚种9株(10.11%)、金黄色葡萄球菌8株(8.99%)和表皮葡萄球菌6株(6.74%)；G-细菌主要为大肠埃希菌20株(22.47%)和肺炎克雷伯菌5株(5.62%)。

2.2各组Th1/Th2细胞因子谱、WBC、CRP、PCT水平比较 各感染评价指标在G+菌感染组、G-菌感染组和健康人对照组间水平比较，差异有统计学意义(P均<0.01)，见表1。组间比较发现，各感染组指标水平均显著高于健康人对照组。其中，G-菌感染组IL-6、IL-10和PCT水平与G+菌感染组比较，差异有统计意义(U=628.00，P<0.01；U=107.00，P<0.01；U=683.00，P<0.05)。

表1 各组Th1/Th2细胞因子谱、WBC、CRP和PCT水平比较[M(P25，P75)]

2.3Th1/Th2细胞因子谱与各感染指标相关性 对Th1/Th2细胞因子谱与临床常见的3种感染指标进行Spearman相关性分析。结果表明，细菌血流感染组和G-菌感染组的IL-6和IL-10表达水平与PCT水平表现出较强的相关性，而G+菌感染组仅IL-10表达水平与PCT呈较强相关性，IL-6水平与PCT表现中等程度相关。此外，细菌血流感染组和G+菌感染组IL-6表达水平与CRP水平分别表现中等和较强相关性，而IL-10与CRP水平呈弱相关。在G-菌感染组中，仅TNF-α表达与PCT水平呈较弱的相关性。细菌血流感染组和G+菌感染组的IFN-γ表达水平与WBC和PCT水平表现为弱的负相关。其余细胞因子如IL-2和IL-4，与WBC、CRP和PCT水平并无相关性(P均>0.05)。见表2。

2.4Th1/Th2细胞因子谱、PCT和CRP诊断细菌性血流感染价值分析 按血培养结果，不同组别间以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，绘制ROC曲线。细胞因子谱在评估患者是否存在细菌性血流感染(图1A)、区分G+细菌性血流感染和非感染(图1B)、G-细菌性血流感染和非感染(图1C)方面均表现出中等到高水平的诊断价值(P均<0.05)。细胞因子谱、PCT和CRP在鉴别G+/G-细菌性血流感染方面，IL-6、IL-10、PCT和CRP曲线下面积分别为0.683、0.702、0.655和0.602(图1D；表3)，对比4种感染指标的诊断效能，差异并无统计学意义(P均>0.05)。4种指标联合其他因子在该研究中未显示对G+/G-细菌性血流感染的区分能力(P均>0.05)。

表2 Th1/Th2细胞因子谱对各感染指标的相关性(r)分析

注：A，区分细菌性感染与非感染；B，区分G+细菌性感染和非感染；C，区分G-细菌性感染和非感染；D，区分G+细菌性感染和G-细菌性感染。图1 Th1/Th2细胞因子谱、CRP和PCT评估细菌性血流感染的ROC曲线

表3 Th1/Th2细胞因子谱、PCT和CRP在鉴别G+/G-细菌性血流感染方面的参数

3 讨论

细菌性血流感染因其复杂的病理生理学机制极易引起机体不同程度的感染，甚至全身性中毒反应，亟需更高效、更有价值的感染标志物以辅助诊断血流感染和指导用药。流式CBA技术是以流式细胞仪为检测平台的液相多重蛋白质定量技术，以不同大小或携带不同荧光信号的微球为载体，能同时定量测量样品中的多种可溶性分子和细胞因子，具有高通量、线性范围广、准确性高和重复性好等诸多优势[1]。流式CBA的应用，突破了传统ELISA检测细胞因子费时费力，尤其不适用于紧急感染患者等方法学限制，使细胞因子谱的临床应用价值研究进一步扩大，Th1/Th2细胞因子谱评估感染研究也愈加深入。

机体感染病原入血后，激活免疫反应释放的多种细胞因子在感染和抗感染过程中相互作用而发挥重要功能，不同类型的病原体由于其独特的结构和抗原成分而释放不同的细胞因子类型和含量[2-3]。如超抗原是金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌为代表的G+菌诱导的有效毒素之一，可不进行抗原提呈，直接触发Th1细胞增殖释放大量促炎因子IL-2、TNF-α和IFN-γ[4]，而内毒素或脂多糖为G-菌的有效毒力因子，会持续活化巨噬细胞使其释放过量促炎因子，放大炎症反应，引起内毒素休克。同时机体诱导抗炎因子以调控免疫失衡，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-1ra、IL-10等多因子明显升高，最终导致机体免疫麻痹[3,5]。本研究发现，Th1/Th2细胞因子谱在机体血流感染后均表现出显著增高，但不同因子增高水平在不同组别中存在差异。其中，IL-6和IL-10在G-菌感染后表达上调最为显著，较G+菌感染组相比差异有统计学意义，与国内外病原感染的相关研究结果一致[6-9]。这一结论有利于感染早期鉴别病原菌类别，有效防止抗菌药物滥用，并且多项研究均表明IL-6和IL-10浓度与血流感染的严重程度及预后相关[6,10-11]。而TNF-α和IFN-γ在本研究中未发现有除识别感染状态外其他的作用。但有文献指出，血清TNF-α水平和动态变化严重影响败血症预后，G-菌败血症水平显著高于G+菌败血症，而前者往往更易发生感染性休克、多器官功能衰竭等高死亡率事件[12]。IFN-γ可与TNF-α发生协同作用，在细胞毒性反应和G-菌败血症中促进细胞膜TNF-α的表达[13]。IL-2和IL-4在不同类型细菌血流感染中变化无差别，且较其他细胞因子血清浓度水平增高幅度不显著，这可能与这2种因子半衰期较短，仅5～19 min有关[14]。Th1/Th2细胞因子谱调节网络复杂，病原感染所涉及的机体免疫相关机制也存在争议。同样，比较血流感染时WBC、CRP和PCT等几种传统感染指标的表现，发现PCT水平在G+菌感染和G-菌感染中表现出差异，WBC和CRP在不同组别中并无特异性。

为深入研究Th1/Th2细胞因子谱与临床常见的3种感染指标的关系，进行Spearman相关性分析。PCT与IL-6在G-菌感染时其相关程度大于G+菌感染，这与研究中G-菌感染时PCT水平增高更明显是一致的。CRP与IL-6也表现出一定相关性。在炎症早期，上皮细胞、T细胞、B细胞、单核细胞和内皮细胞等均可分泌高水平的IL-6，并进一步促进肝脏合成并释放PCT和CRP。IFN-γ与临床常规感染指标WBC和PCT呈弱的负相关，这可能由于严重病原感染菌血症时，IFN-γ大量消耗或产生不足，又或二者共同作用所致[6,15]，其详细机制还需进一步探索。

绘制ROC曲线分析Th1/Th2细胞因子谱、CRP和PCT诊断细菌性血流感染价值，Th1/Th2细胞因子谱具有区分是否感染的明显优势，IL-6和 IL-10在鉴别G+菌和G-菌感染中表现不同浓度水平的变化趋势和诊断效能。ROC曲线证实IL-10对血流感染中G-菌感染有较好的诊断效果，IL-10>56.775 pg/mL，患者更有可能发生G-菌血流感染，并且敏感性可以达到89.10%。IL-6在这方面敏感性较差，但较高的特异性可作为感染的排除指标，IL-6<57.260 pg/mL认为更有可能排除G-菌感染导致的菌血症。比较IL-6、IL-10、PCT和CRP的AUC，未发现IL-6、IL-10的鉴别细菌感染类型的性能优于后两者，这与Xu等[16]在儿童肿瘤患者识别G-菌血症和脓毒症休克的研究中IL-6和IL-10鉴别效果优于PCT和CRP的结论相异，差异可能是由于研究人群的差别和本研究标本量较少所致。

综上，Th1/Th2细胞因子谱作为细菌性血流感染新的标志物具有其显著优势，通过比较IL-6和IL-10表达水平，有助于提示临床病原菌分类，为临床病原诊断及用药提供实验室依据。本研究仍存在一些不足，一方面研究结果仍受到样本数量的限制；另一方面未考虑感染指标的采集时间相对于感染开始的不同动力学，研究数据来自临床常规检测报告，可能不是每种感染标志物识别病原菌的最佳表现。