Optochin试验和胆汁溶解试验及MALDI-TOF MS在肺炎链球菌鉴定中的应用价值*

金优萍，徐丽慧，余道军，张卫英

(1.浙江中医药大学医学技术与信息工程学院，杭州310053；2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院检验科，杭州310006)

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)是临床常见的机会性致病菌，可定植于鼻咽部，常可引起肺炎、中耳炎、化脓性脑膜炎、败血症等疾病[1]。WHO在2014年报告中指出肺炎是全球第四大死因[2]，对老年和儿童群体都构成严重疾病负担[3-5]。

肺炎链球菌感染的病原学诊断有赖于临床微生物实验室分离鉴定肺炎链球菌。目前不同级别医院实验室鉴定肺炎链球菌所采用的方法不尽相同，部分三级医院实验室都配备了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)仪，而基层实验室还是以奥普托辛(Optochin)试验为主并辅以胆汁溶解试验，且不同鉴定方法的检测性能研究报道较少。分子生物学技术的不断发展为确认肺炎链球菌提供了更多可能。近年来有学者通过对链球菌属细菌基因组高通量测序和生物信息学分析，发现SPN0001检测肺炎链球菌的敏感性和特异性达到100%，可作为肺炎链球菌分子鉴定的特异性标记[6]。

因此，本研究以SPN0001检测阳性为肺炎链球菌判定标准，对疑似肺炎链球菌的282株α溶血链球菌用上述3种鉴定方法进行检测分析，并综合评价其应用价值，探讨适合临床微生物实验室应用的准确快速鉴定肺炎链球菌的方法。

1 材料与方法

1.1菌株来源与复苏 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院检验科2015—2019年临床分离疑似肺炎链球菌的α溶血链球菌共计282株(20%甘油肉汤中-70 ℃保存)。菌株复苏时转种至哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图生物公司)，置于35 ℃、5%CO2培养16～18 h。用肺炎链球菌ATCC 49619为质控菌株。

1.2试剂与仪器 PCR试剂包括10×buffer、dNTPs混合液和Ex taq酶(TaKaRa公司)，SPN0001引物(上游5′-AATATCTGAAGATGCTCATTCTACAATT-3′，下游5′-ATAAGGTTTACCGTCAATAATACGCAG-3′)[6]由上海铂尚生物技术有限公司合成，100～2 000 bp DNA marker(上海生工生物公司)，Optochin药敏纸片(含量5 μg，直径6 mm，Oxoid公司)。凝胶成像仪、琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司)，5%CO2培养箱(Thermo公司)，MALDI-TOF MS质谱仪(德国Bruker Daltonics公司)。

1.3分子生物学鉴定 282株α溶血链球菌分别以煮沸法(100 ℃ 10 min)提取核酸，行PCR检测。扩增体系共25 μL，包括无菌水18.4 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs混合液2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.1 μL，模板1 μL。扩增参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环； 72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察电泳结果。随机分别选取肺炎链球菌特异性靶标基因SPN0001检测结果阳性者5株及检测结果阴性11株菌株，用细菌16S rRNA为靶标基因的引物行PCR检测[7]，PCR条件同SPN0001，PCR扩增产物送上海铂尚生物技术有限公司测序。PCR产物经纯化后变性在3730测序分析仪(美国ABI公司)上进行Sanger双脱氧终止测序法测序分析。用16S rRNA测序比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)结果对肺炎链球菌特异性标记物SPN0001检测的准确性进行验证。

1.4Optochin试验 282株α溶血链球菌和质控菌株复苏后取单个菌落划线法接种于血平板上，在35 ℃、5%CO2中培养18～24 h，用纸片法行Optochin试验。Optochin药敏纸片抑菌圈≥14 mm判定为敏感(Opts)，抑菌圈<14 mm或抑菌圈中出现菌落者判定为耐药(Optr)[8]。

1.5胆汁溶解试验 菌株复苏后以平板法进行胆汁溶解试验。取实验室自配10%去氧胆酸钠溶液5 μL，滴加于被测菌的菌落上，置35 ℃培养15～30 min后观察结果。以“菌落消失”判为胆汁溶解试验阳性，反之为阴性[8]。

1.6MALDI-TOF MS鉴定 菌株复苏后用无菌吸头挑取单个菌落，直接均匀涂布于MALDI靶板。同时用已知蛋白质标准品设2孔作为校准。待干燥后，每孔加入基质液1 μL，干燥后用MALDI-TOF MS仪进行检测，分值2.3～3.0为高置信的种水平鉴定；分值2.0～<2.3为确定的属水平鉴定，可能的种水平鉴定；分值1.7～<2.0为可能的属水平鉴定；分值0.0～<1.7为不可靠的鉴定[9]。采用鉴定分值≥2.0且取分值最高者为鉴定结果。

1.7统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行。采用行×列队卡方检验比较Optochin试验、胆汁溶解试验及MALDI-TOF MS在鉴别α溶血链球菌的差异。采用配对卡方检验比较任意2种方法在鉴别α溶血链球菌中的差异。双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1分子生物学鉴定 以SPN0001为检测靶标行PCR扩增获得154 bp扩增产物，以16S rRNA为靶标行PCR获得928 bp扩增产物，见图1。282株α溶血链球菌中，234株SPN0001阳性菌株，48株SPN0001阴性菌株。以简单随机抽样法抽取5株SPN0001阳性菌株，经16S rRNA测序确认为肺炎链球菌(100%)；11株SPN0001阴性菌株经16S rRNA测序指向α溶血的非肺炎链球菌(98%～100%)，包括假肺炎链球菌或缓症链球菌 8株、口腔链球菌2株、血链球菌1株。

注：1，DNA marker(100～2 000 bp)；2，SPN0001阳性(154 bp)；3，16S rRNA PCR产物(928 bp)；4，SPN0001阴性。

2.2Optochin试验 282株α溶血链球菌中213株为Opts，69株为Optr。234株肺炎链球菌中Opts和Optr分别为204株和30株，肺炎链球菌Optochim的耐药率为12.82%；48株非肺炎链球菌中有9株Opts菌株。其检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表1。

2.3胆汁溶解试验 282株α溶血链球菌中235株表现为胆汁溶解试验阳性，47株表现为胆汁溶解试验阴性。其检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表1、表2。

2.4MALDI-TOF MS鉴定 282株α溶血链球菌中247株被鉴定为肺炎链球菌，其余35株为非肺炎链球菌(缓症链球菌 25株、口腔链球菌6株、血链球菌和副溶血链球菌各2株)。234株肺炎链球菌的MALDI-TOF MS鉴定结果均为肺炎链球菌。但还有13株非肺炎链球菌MALDI-TOF MS鉴定结果也显示为肺炎链球菌。其检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表1。

2.5组合试验鉴定肺炎链球菌 MALDI-TOF MS组合胆汁溶解试验的鉴定性能同单独胆汁溶解试验，但优于MALDI-TOF MS组合Optochin试验的鉴定性能。Optochin试验组合胆汁溶解试验或MALDI-TOF MS的鉴定性能优于单独Optochin试验。见表2。

2.6统计学分析 Optochin试验、胆汁溶解试验及MALDI-TOF MS 3种方法对282株α溶血链球菌鉴定结果的差异具有统计学意义(χ2=14.381，P<0.05)。通过配对卡方检验分析，Optochin试验与胆汁溶解试验对282株α溶血链球菌鉴定结果的差异具有统计学意义(χ2=104.476，P=0.000)；胆汁溶解试验与MALDI-TOF MS对282株α溶血链球菌鉴定结果的差异具有统计学意义(χ2=199.798，P=0.000)；MALDI-TOF MS与Optochin试验对282株α溶血链球菌鉴定结果的差异具有统计学意义(χ2=114.198，P=0.000)。

表1 Optochin试验和胆汁溶解试验及MALDI-TOF MS对282株α溶血链球菌的鉴定结果

表2 不同肺炎链球菌鉴定试验组合对282株α溶血链球菌的鉴定结果

3 讨论

肺炎链球菌是临床重要的病原菌，由于其与假肺炎链球菌、缓症链球菌、口腔链球菌等非肺炎链球菌在进化关系上紧密[10]，以及链球菌物种之间发生水平基因转移[11]，使其许多表型和分子特征相似，导致临床难以准确鉴定肺炎链球菌。临床实验室常用的鉴定肺炎链球菌鉴定试验有Optochin试验和胆汁溶解试验[12]，近年来采用MALDI-TOF MS鉴定肺炎链球菌的实验室越来越多。本研究选择以分子生物学方法检测SPN0001阳性为肺炎链球菌判定标准，对以上3种方法鉴定肺炎链球菌的检测性能进行对比研究。

Optochin是一种奎宁衍生的抗菌药物，通过结合H+-ATPase的F0部分的c亚单位，阻止其螺旋变构，导致H+无法被泵出而形成胞内pH降低以及电荷紊乱而导致细菌死亡[13]。Optochin试验已成为鉴定肺炎链球菌的主要方法[12]。但随着对α溶血链球菌的了解增加，发现部分假肺炎链球菌可表现为Opts[14]，因此不能单凭Optochin敏感性试验确认肺炎链球菌，另一方面，已有报道肺炎链球菌H+-ATPase的F0部分的c亚单位和a亚单位的碱基突变导致对Optochin产生耐药[15]，因此其敏感性和特异性均值得重新评价。本研究中有部分非肺炎链球菌表现为Optochin敏感，其是否为假肺炎链球菌有待进一步鉴定。而肺炎链球菌对Optochin耐药的机制是否存在上述碱基突变需要进一步确证。

胆汁溶解试验是以脱氧胆酸盐溶解链球菌细胞壁，由于肺炎链球菌存在自溶素基因lytA，表现为该试验阳性。胆汁溶解试验作为传统的鉴定肺炎链球菌方法，其优点是准确度高[16]，本研究中其敏感性和特异性分别为100%和97.92%，与其他研究者对胆汁溶解试验的评价较一致[17]。但在判断结果方面，客观性较MALDI-TOF MS和Optochin试验差[18]，结果需要有经验的实验室人员做出正确的判断，因此，限制了胆汁溶解试验在临床实验室的应用。但胆汁溶解试验仍作为鉴定肺炎链球菌的首选和推荐方法，实验室应每年定期进行相关人员培训以及判读的人员比对工作，尽量减少人员主观判读的差异性。有研究者提出测定胆汁溶解试验新方法，即通过测量链球菌悬浮液浊度下降程度判定试验结果，可有效避免主观判读[17]。但该方法需要一定量的菌落，且不便于大样本批量操作。也有文献报道MALDI-TOF MS联合胆汁溶解试验的方法，将胆汁溶解结果以MALDI-TOF MS测定分值进行判断，可有效消除胆汁溶解试验在实际应用中受到的主观判断结果的局限性[19]，又能方便大批量样本的操作。可以将该方法进行进一步的验证，在实际工作中推广使用。

MALDI-TOF MS基于细菌丰富的肽和小蛋白质经MALDI-TOF MS转换成独特质荷比信号所构成的该细菌特征峰谱进行快速鉴定[20]。 有研究者总结了MALDI-TOF MS鉴定肺炎链球菌的敏感性为99%，但是缓症链球菌和口腔链球菌极容易被鉴定为肺炎链球菌[21]。同样，本研究结果显示MALDI-TOF MS鉴定肺炎链球菌的敏感性高达100%，且操作方便、结果判读客观，因此可以作为肺炎链球菌鉴定的筛选方法，但其特异性只有72.92%，因此鉴定为非肺炎链球菌的结果可靠，而对鉴别为肺炎链球菌的结果需要进一步用其他方法进行确认。

本研究结果表明MALDI-TOF MS鉴定快速且敏感性为100%，而胆汁溶解试验的敏感性为100%、特异性为97.92%，Optochin试验的检测性能有限，因此在检测策略上，MALDI-TOF MS组合胆汁溶解试验鉴定肺炎链球菌优于MALDI-TOF MS组合Optochin试验。因此，如果实验室能规范应用胆汁溶解试验，则可以在日常鉴定肺炎链球菌时，先用MALDI-TOF MS进行初筛，对于初筛阳性再行胆汁溶解试验进行验证，以提高肺炎链球菌鉴定效率和可靠性。如果实验室没有MALDI-TOF MS，且胆汁溶解试验判定结果可靠的前提下，建议可行胆汁溶解试验快速、准确、低成本地鉴定肺炎链球菌。对于有条件的实验室，采用基于肺炎链球菌SPN0001为靶基因的分子生物学方法鉴定肺炎链球菌结果更为准确，因为肺炎链球菌SPN0001基因具有高度保守性和特异性的特点。而随着分子生物学技术的进步，今后可能会有更优的方法实现高通量、快速、准确鉴定肺炎链球菌。