LC-MS/MS 法测定人血浆中米拉贝隆及其中国健康人体药动学研究

陈 敏，范宇轩，程旻露，刘海俊，丁 黎*

1珠海同源药业有限公司，广东珠海 519041；2 中国药科大学药物分析研究室，南京 211100；3 南京科利泰医药科技有限公司，南京211100

膀胱过度活动症（OAB）是以尿频、夜尿、急迫性尿失禁等症状为特征的综合征[1]。2011 年的临床问卷调查结果显示，中国人OAB 的总发病率为6.0%[2]。米拉贝隆（mirabegron）是第一个用于治疗OAB 的高选择性β3 受体激动剂（结构式见图1），与现行的OAB 一线药物抗胆碱能药相比，该药不良反应发生率低，具有良好的应用前景[3]。目前，在已有的米拉贝隆LC-MS/MS 检测文献中，所采用的样品前处理方法有液液萃取法（LLE）[4]、固相萃取法与固相支撑-液液萃取法（SLE）[5]。这些方法前处理时间较长、操作较繁琐、成本较高，具有一定的局限性；其次米拉贝隆结构中的酰胺键可能被血浆中的酯酶水解，影响检测的稳定性。本研究设计了在冰浴上操作并在血浆样品中加入氟化钠作为酯酶抑制剂来稳定米拉贝隆的样本处理技术，建立蛋白沉淀血浆样品前处理方法，用于人血浆中米拉贝隆的LC-MS/MS 浓度测定，并应用于米拉贝隆缓释片在中国健康人体内的药动学研究。

图1 米拉贝隆结构式

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

米拉贝隆对照品（批号：2-KME-45-1，纯度：99.90%，TRC）；米拉贝隆-d5（内标，批号1961-094A3，纯度：99.5%，TLC）；米拉贝隆缓释片（贝坦利®，批号20I2035，Avara Pharmaceutical Technologies Inc）。乙腈、甲醇、异丙醇为色谱纯；甲酸、醋酸铵（美国化学协会标准试剂）；超纯水。

1.2 仪器与设备

岛津高效液相色谱仪（LC-30AD 液相泵，CTO-20AC 柱温箱，CBM-20A Lite 控制器，DGU-20A5R脱气机，SIL-30AC 自动进样器）；质谱仪（Triple QuadTM5500，Applied Biosystems/Sciex，USA）；色谱工作站：Analyst 1.6.2、Analyst 1.6.3；数据处理软件：Microsoft Office 2013 或他版本，Watson LIMS 7.5 SP1；主要药代动力学参数使用Phoenix Win-Nonlin software（version 7.5）处理。

1.3 检测条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：ACE Excel 3AQ（100 mm×2.1 mm，Advanced Chromatography Technologies）；预柱：Security Guard Cartridges C18（4mm×2.0 mm，Phenomenex）；流动相A 为含0.1%甲酸和5.00 mmol·L-1醋酸铵的水溶液，流动相B 为含0.1%甲酸和5.00 mmol·L-1醋酸铵的90%乙腈水溶液；柱温40℃；流速0.400 mL·min-1；进样体积10 μL；自动进样器温度8℃。

梯度洗脱程序：0.00～0.30 min，10% B；0.30～0.40 min，10%～18% B；0.40～2.70 min，18% B；2.70～2.80 min，18%～90% B；2.80～3.70 min，90% B；3.70～3.80 min，90%～10% B；3.80～5.00 min，10% B。

1.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子化，正离子模式，多反应监测，裂解电压2500 V，气帘气压力206.85 kPa，雾化气压力344.75 kPa，辅助气压力413.7 kPa，干燥气温度600℃，检测反应离子对：米拉贝隆m/z 397.2→260.0，米拉贝隆-d5 m/z 402.2→260.0。米拉贝隆质谱参数DP：92V；EP：5V；CE：27V；CXP：20 V。米拉贝隆-d5 质谱参数DP：92 V；EP：5 V；CE：27 V；CXP：20 V。0.8 min 切入质谱，3.5 min 切出质谱，共采集2.7 min。

1.4 溶液的配制

采血使用预冷的含氟化钠的肝素钠（抗凝剂）真空管，4℃、2000 g 离心10 min，将上层血浆在冰浴条件下转移至冻存管中得到空白健康人血浆。米拉贝隆及内标储备液与工作溶液的配制：精密称取米拉贝隆对照品适量，经质量校正系数校正后，用100%甲醇溶解配制成浓度为1.00 mg·mL-1的储备液，用50%甲醇逐级稀释，得到浓度范围为3.20 ng·mL-1～1700 ng·mL-1的标曲及质控工作溶液以及40.0 ng·mL-1的内标工作溶液。储备液于-20°C 下在棕色玻璃瓶中长期保存，质控工作溶液于-20°C 下在透明聚丙烯管中保存。在方法验证中，将相应的工作溶液加入到上述空白人血浆中，每天新鲜配制。

1.5 血浆样品的前处理

在冰浴条件下，于96 孔板中加入50.0μL 血浆样品和25.0μL 内标工作溶液（40.0ng·mL-1），混匀1min后加入175 μL 甲醇，将密封后的96 孔板在振荡器上振摇10 min，再以25℃、4000 r·min-1离心10 min，取50.0 μL 上清液转移至含有150 μL 超纯水的另一96 孔板中，涡旋混匀后行LC-MS/MS 分析。

1.6 米拉贝隆的药动学研究

试验方案经成都中医药大学附属医院伦理委员会审核批准，临床注册号为CTR20201584。试验为单中心、健康受试者药代动力学研究。共入选20名中国健康受试者，男女皆有，汉族，年龄22～49岁，男性体重≥50 kg，身高160～175 cm，女性体重≥45 kg，身高154～162 cm，体重指数（BMI）在19.0～26.0 kg·m-2。受试者签署知情同意书。符合入组要求的受试者于试验前一日进入Ⅰ期临床试验病房，隔夜禁食10 h，空腹口服米拉贝隆缓释片50 mg，240 mL温水送服。于0 h（服药前1 h 内）、服药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.33、2.67、3.0、3.33、3.67、4.0、4.33、4.67、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0 h共24 个点各采集静脉血3 mL，样品置含氟化钠的肝素钠采血管并立即放入冰浴中，1 h 内转移至预冷的离心机，4℃、2000 g 离心10 min，取1 mL 上层血浆在冰浴下转移到冻存管，储存于-70℃超低温冰箱。以LC-MS/MS 法测定血浆中米拉贝隆的浓度供药动学分析。

2 方法学验证及结果

2.1 标准曲线及定量下限

配制含米拉贝隆对照品浓度分别为0.160、0.320、1.50、6.00、25.0、50.0、85.0 ng·mL-1的标准含药血浆，按“1.5”项前处理后进样检测，记录色谱图，计算米拉贝隆色谱峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面积比值f 对米拉贝隆的血药浓度X（ng·mL-1）为横坐标，待测物与内标面积比值Y为纵坐标，用加权（W=1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得标准曲线方程为：Y=0.07142X+8.467×10-4，r2=0.998 1。结果表明，药物浓度在0.160～85.0 ng·mL-1范围内线性关系良好，定量下限（LLOQ）为0.160 ng·mL-1，连续测定3批，每批6份，LLOQ 样品批内平均准确度为98.3%，批间准确度为98.1%。

2.2 选择性

取空白人血浆，按选定的色谱条件，将空白血浆、空白血浆+米拉贝隆定量下限标准曲线样品、内标，按“1.5”项前处理后进样检测，考察方法的选择性。作为不含待测物及内标的双空白样品在待测物或内标保留时间附近，应不出现显著干扰。结果表明，本实验条件下，米拉贝隆出峰时间在2.62 min 左右，内标出峰时间在2.57 min 左右，峰形良好，在出峰位置无杂峰干扰测定，基线平稳，色谱图见图2。

图2 血浆中米拉贝隆（Ⅰ）以及内标（米拉贝隆-d5）（Ⅱ）的典型的MRM 色谱图

2.3 精密度及准确度试验

用6 个重复的质控样品0.160 ng·mL-1（LLOQ QC），0.450 ng·mL-1（LQC），5.00 ng·mL-1（GMQC），20.0 ng·mL-1（MQC），64.0 ng·mL-1（HQC）分别按“1.5”项进行前处理，根据随行标准曲线求得实测浓度，在同一分析批中和连续3 个分析批中评估批内与批间的准确度与精密度，结果见表1。

表1 血浆中米拉贝隆LC-MS/MS 测定的精密度与准确度

2.4 稳定性试验

考察人血浆中米拉贝隆在冰浴21.8h、室温3.4h、-20℃下5 个冻融循环的稳定性，以及在-20℃下81天的长期稳定性。共考察低浓度质控样品（LQC）和高浓度质控样品（HQC）两个浓度水平，每个浓度水平3 个重复，在不同条件下，各浓度水平的测定值与理论值的平均偏差均在±15%范围内，表明人血浆中米拉贝隆在各实验条件下均稳定，其数据见表2。

表2 米拉贝隆的血浆稳定性

2.5 提取回收率试验

通过比较单个质控样品中待测物或内标响应值与提取后加入待测物、内标的双空白样品的响应值，来评价样品的提取回收率。共考察3 个浓度的质控样品（0.450、20.0、64.0 ng·mL-1），每个浓度样品进行6 次重复样本分析。所有浓度的血浆样品中米拉贝隆的提取回收率为95.7%～99.4%，精密度RSD为1.9%<15.0%，说明该方法的提取回收率良好。

2.6 基质效应

使用6 个不同来源的空白人血浆，来考察内标工作液浓度下和待测物低（LQC）、中（MQC）、高（HQC）浓度下的基质效应。计算每个来源空白基质存在下的峰面积与不含基质的样品（相同浓度米拉贝隆标准品及其内标的混合纯溶液）相应峰面积的比值，得到每一待测物和内标的基质因子，再用待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，结果为（101.3±10.8）%，表明血浆中内源性物质不干扰测定，而基质效应可以忽略不计。

2.7 残留效应

以进样定量上限样品（ULOQ）85.0 ng·mL-1后，随即进样双空白样品的进样序列，循环进样6次，考察方法的残留效应，6 个双空白样品中待测物的平均峰面积响应值与同分析批定量下限样品平均峰面积响应值的比值为5.4%（20.0%）。结果表明，ULOQ 样品后的空白血浆提取物在待测物出峰位置无干扰，表明该方法残留效应符合要求。

3 药代动力学研究

按“1.5”项下方法处理样品并测定浓度，随行标准曲线定量上限样品与定量下限样品的批内平均准确度分别为99.8%与100.49%。主要药代动力学参数使用Phoenix WinNonlin software（version 6.4）依赖非房室模型计算，20 名受试者血浆中米拉贝隆的平均药-时曲线见图3，其药代动力学参数见表3。

表3 米拉贝隆的主要药代动力学参数（n=20）

图3 20 名健康受试者空腹口服米拉贝隆缓释片50 mg 后米拉贝隆的血药浓度均值-时间曲线

4 讨论

本研究开发了成本较低、操作简单、前处理时间较短的蛋白沉淀法，且所建立的检测方法准确度好、灵敏度高。人血浆中常含有羧酸酯酶，主要对包含酯键、酰胺类、氨基甲酸酯和硫代酸酯类结构的药物有水解作用，因此米拉贝隆结构中的酰胺键在血浆中不稳定，易被水解。抑制酯酶水解的方法通常为冰浴、加酸或添加酯酶抑制剂，本研究采取冰浴以及在全血采集时向肝素钠采血管中加入氟化钠作为酯酶抑制剂的方法，可以有效地防止米拉贝隆被人血中的酯酶水解。在米拉贝隆缓释片单剂量空腹口服给药条件下，中国健康人体药代动力学特征鲜有报道，查阅文献可知相同给药剂量空腹条件下日本受试者[4]以及欧洲受试者[6]的tmax均值为3.5、3.95h，t1/2均值分别为39.3、43.8h，AUC0-∞分别为387.1、241.9h·ng·mL-1，可发现3 个不同地域的受试者达峰时间接近，欧洲人的半衰期较长、暴露量较低。本试验结果可为米拉贝隆人血浆浓度检测及临床应用的安全性、有效性研究提供一定的参考。