甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶异源表达及协同催化降解甲醛的研究*

2022-02-01陈雨点刘文书李勇昊

广州化工 2022年22期

莫易，彭念，陈雨点，李倩，刘文书，李勇昊

(重庆科技学院化学化工学院，工业发酵微生物重庆市重点实验室(重庆科技学院)，重庆 401331)

甲醛是建筑材料中常见污染物，被我国列为第二位优先控制的有毒化学品[1]。致癌和致畸作用是甲醛对人体健康造成危害的主要因素[2]。据报道长期(>1年)处于甲醛(0.107± 1.694)mg/m-3环境会增加淋巴细胞微核细胞率[3]。我国已颁布《室内空气质量标准》(GB/T18883-2002)，规定甲醛最大允许浓度为0.08 mg/m-3[4]。因此开发降解甲醛的方法势在必行。

目前甲醛处理方法主要包括物理吸附和光催化，但仍存在需要特定反应条件、低效率及不环保等缺点。近年来植物和微生物的生物酶催化甲醛降解被认为是具有应用前景的替代技术[5]。Kondo T等[6]分离到一株可完全消耗0.45%甲醛浓度的真菌；牛成洁等[7]利用甲醛降解菌开发了室内甲醛净化设备；然而从自然界中分离降解甲醛微生物所需工作量大，且要保证菌株次级代谢产物对人无害，因此利用基因工程手段理性表达甲醛降解关键蛋白具有一定优势。张婧等[8]将FADH和FDH固定到聚丙烯酰胺上发现对甲醛有吸附效果，但该研究并未具体表征FDH对FADH降解甲醛效果的影响。

本研究将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源FADH和博伊丁假丝酵母菌(Candidaboidinii)FDH基因经密码子优化后克隆到pET26b载体，转化到蛋白酶缺陷菌株EscherichiacoliER2566并尝试利用IPTG诱导T7启动子表达两种生物酶，最后探讨FDH对FADH降解甲醛效率的影响，预期研究成果对实现高效且环保降解甲醛提供参考。

1 实验

1.1 材料与试剂

1.1.1 质粒与菌株

蛋白酶缺陷感受态E.coliER2566购自上海唯地生物技术有限公司，克隆菌株E.coliDH5α和表达载体pET26b由作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂

质粒抽提试剂盒(B518191)、DNA胶回收试剂盒(B518131)、SDS-PAGE试剂盒(C631100)、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨，生工生物工程(上海)股份有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)，上海碧云天生物技术有限公司；DNA marker(TSJ011)，北京擎科生物科技有限公司；甲醛测定试剂盒(090380)，广东环凯微生物科技有限公司；甲醛溶液，分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司。LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L和酵母提取物5 g/L。

1.1.3 仪器与设备

ZWY-240型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；SCQ-1500F超声波破碎仪，上海声彦超声波仪器有限公司；iMark吸收光酶标仪，美国Bio-rad公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；5811台式冷冻大容量离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 载体构建

恶臭假单胞菌fadh基因(GenBank：D21201)和博伊丁假丝酵母fdh基因(GenBank：O13437)进行密码子优化后，fadh基因通过HindⅢ和SalI酶切位点连入pET26b中，fdh经NdeⅠ和XhoⅠ连接到pET26b；载体构建在E.coliDH5α，质粒测序正确后转入E.coliER2566表达。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化

单克隆菌株在5 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中37 ℃过夜活化，1%接种量至50 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中37 ℃，180 r/min培养至OD600为0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导4 h后发酵液在4 ℃，6000 r/min离心6 min，弃上清。用磷酸盐缓冲液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)洗涤菌体，离心后重悬于30 mL缓冲液进行超声破碎。条件为300 W，破碎3 s停止5 s，共20 min。离心取上清为粗酶液，过Ni柱得到纯化的FADH和FDH蛋白，通过SDS-PAGE检测蛋白表达和纯度。

1.2.3 甲醛降解分析

50 mmol/L磷酸钾缓冲液，1 mg/L甲醛，1 mmol/L NAD+，加入一定量的重组蛋白混合物于3 mL的反应体系中，置于 40 ℃温育24 h后通过1.1.2所述试剂盒测定甲醛浓度。

2 结果与分析

2.1 重组菌株的构建

蛋白表达载体如图1所示，图1A和B分别为表达FADH和FDH蛋白的质粒图，可知质粒为卡那霉素抗性，利用T7启动子表达基因，且在蛋白碳端具有组氨酸标签，后续可以使用Ni柱纯化蛋白；图1C为质粒验证电泳图，fadh和fdh基因大小分别为1197 bp和1092 bp，电泳条带与预计大小相符，进而测序结果证明碱基无突变。后续可以使用IPTG诱导相应基因表达。

M： DL2000 marker; 1： FADH; 2： FDH图1 重组载体的验证Fig.1 Verification of recombinant vectors

2.2 重组蛋白的表达与纯化

发酵粗酶液及纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示。图2A中条带1是野生菌ER2566发酵的粗酶液，条带2是重组菌ER2566-FADH发酵的粗酶液，条带3是重组菌ER2566-FADH的纯化蛋白，说明FADH成功在E.coliER2566中异源表达并纯化。图2B中条带1是野生菌ER2566发酵的粗酶液，条带2是重组菌ER2566-FDH发酵的粗酶液，条带3是重组菌ER2566-FDH的纯化蛋白，说明FDH蛋白成功在E.coliER2566中异源表达并纯化。FADH和FDH重组蛋白相对分子质量均约为45 kD，与理论推定值相符。FADH的大小与景爱霞等[9]在大肠杆菌中表达甲基营养菌 MP688的结果(55 kD)有一定差别，分析原因主要是使用基因不同。FDH的大小与张婧等[8]报道的结果(45 kD)相似。

图2 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达水平和纯化程度Fig.2 SDS-PAGE to detect the expression level and purification degree of recombinant protein

2.3 FADH与FDH对甲醛降解效果分析

将纯化后的FADH和FDH对甲醛降解效果进行分析。如图3所示，初始的溶液甲醛浓度为1 mg/L， 1 μg FDH重组蛋白处理后溶液的甲醛浓度减少了0.009 mg/L，甲醛浓度几乎没有变化，说明FDH作为酶具有专一性，不具备降解甲醛的能力；2.8 μg FADH重组蛋白处理后溶液的甲醛浓度为0.924 mg/L，甲醛浓度下降了7.6%；2.8 μg FADH和1 μg FDH重组蛋白混合物处理后溶液的甲醛浓度为0.479 mg/L，甲醛浓度下降了52.1%，比张婧等[8]用固定化的FADH和FDH降解甲醛的效率(40%)有所提高，说明提高FADH与FDH比例可以提高甲醛降解效率。使用FADH和FDH重组蛋白混合物降解甲醛效率是FADH的6.8倍，证明FDH重组蛋白虽然不能降解甲醛，但可以显著提高FADH对甲醛的降解效果。这可能是因为FDH的存在使甲酸降解为二氧化碳，低浓度的甲酸导致FADH降解甲醛的反应向正反应方向移动，从而提高了降解甲醛的效率，同时无甲酸污染。