原发性肺淋巴上皮癌41例临床病理及分子遗传学分析

马善宝，郑巧灵，延永琴，齐兴峰，刘庆宏，曲利娟

肺淋巴上皮癌(lymphoepithelioma carcinoma, LEC)是一种具有大量淋巴间质、分化差的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，为临床少见的、与EBV感染密切相关的恶性上皮性肿瘤，可发生于全身任何器官，仅占所有肺癌的0.92%。由于肺LEC的低发病率、发病机制及驱动基因突变不明确，目前临床治疗经验有限。随着免疫疗法的兴起，程序性细胞死亡1(programmed death-1, PD-1)/程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)抑制剂已成为NSCLC的重要治疗方法[1]，但PD-1/PD-L1在肺LEC中的表达及相关治疗疗效数据有限，仍有待进一步探究。本文回顾性分析41肺LEC临床病理特征及PD-1/PD-L1在肺LEC中的表达情况，为临床开展新的免疫治疗方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2017年1月～2021年12月解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科存档的肺LEC手术切除标本41例，所有患者均接受鼻咽内镜检查以排除鼻咽部转移性LEC，临床病理资料完整。其中发病年龄27～77岁，中位年龄54岁，男女比为1.2 ∶1，其中吸烟者4例。按照第8版肺癌肿瘤TNM分期系统进行分期。随访资料通过电话形式获取信息，随访时间6～54个月，其中3例出现胸腔、肝和骨等部位远处转移。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行HE及免疫组化染色，镜下观察。PD-1抗体(稀释比1 ∶50)购自SIGMA公司，PD-L1(克隆号SP263)检测采用罗氏OptiView法，每次实验均设置阳性和阴性对照，其余免疫组化检测试剂盒购于福州迈新公司，免疫组化染色采用EnVision两步法，所用抗体包括CK5/6、p40、p63、CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56。EBER原位杂交染色试剂盒购自北京中杉金桥公司，采用辣根过氧化物酶系统，DAB显色。另切取相应石蜡包埋组织4 μm厚切片5～10张，利用石蜡组织DNA/RNA共提取试剂盒提取DNA及RNA，采用扩增阻滞突变系统(ARMS)PCR检测RET、ROS1、EGFR、HER-2、PIK3CA、BRAF、KRAS和ALK基因突变情况，PCR具体操作及结果判读均按试剂盒说明书进行，试剂盒购自厦门艾德生物医药公司。

1.3 结果判断CK5/6、CK7、Napsin A、Syn、CgA表达定位于细胞质，CD56表达定位于细胞膜，p40、p63、TTF-1表达定位于细胞核。PD-L1阳性判断[2-3]：以任何强度的细胞质或细胞膜染色肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比计算：0～1%为阴性，≥1%为阳性，其中1%～49%为低表达，≥50%为高表达。PD-1阳性判断[4-5]：以细胞计数法评估：低倍镜下观察整张切片，寻找淋巴细胞密度较高处，随机选择5个高倍视野(400×)，每个视野计数100个细胞中PD-1阳性细胞数，求其平均值作为PD-1阳性细胞数。以所有病例PD-1阳性细胞数均数为阈值，>该阈值即为PD-1阳性，<该阈值即为PD-1阴性。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验，当样本量<5时进行Fisher确切检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征本组41例LEC中有34例(34/41，82.93%)无症状患者为体检偶然发现，仅7例(7/41，17.07%)患者出现临床症状，主要表现为咳嗽、咳痰、咯血或胸闷。肿瘤部位：中央型11例、周围型30例，具体分别为左肺上叶2例(5%)、左肺下叶11例(27%)、左下肺门2例(5%)、右肺上叶6例(14%)、右肺下叶13例(32%)、右肺中叶7例(17%)。临床分期：Ⅰ期21例(51%)，Ⅱ期4例(10%)，Ⅲ期13例(32%)，Ⅳ期3例(7%)。所有患者均在首诊时进行了血清肿瘤标志物检测：CA199升高1例，CA125和CEA升高各2例，NSE升高4例，细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)升高11例，其他血清肿瘤标志物均阴性。所有患者均经手术切除病灶，接受新辅助治疗者3例，接受辅助治疗者19例，化疗周期>4个疗程者7例。随访截至2021年12月31日，随访时间6～54个月，患者均存活，其中3例分别出现胸腔、肝和骨转移。

2.2 病理检查眼观：41例手术根治标本，肿瘤呈结节状，大小不等，肿瘤最大径0.5～9.8 cm(中位最大径3.2 cm)，均无明显包膜，境界欠清，切面灰白色，质中，部分伴坏死。镜检：41例肿瘤组织学特点相似，低倍镜下肿瘤细胞呈弥漫片状浸润性生长，具有明显的推进性边界；肿瘤细胞界限不清，呈合体细胞样生长，细胞核大、空泡状，具有明显的嗜酸性核仁；间质有明显的淋巴上皮病变及炎性反应，浸润细胞以成熟的淋巴细胞为主，常伴有浆细胞和组织细胞(图1)，个别病例伴嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；部分病例可见肉芽肿性炎(8例)(图2)、局灶角化(4例)(图3)、肺泡腔播散(3例)。

2.3 免疫表型及原位杂交肿瘤细胞CK5/6(41/41)(图4)、p40(41/41)(图5)、p63(41/41)、PD-L1(37/41)阳性，其中16例(16/41)肿瘤细胞PD-L1呈高表达(图6)；17例(17/41)肿瘤间质淋巴细胞PD-1阳性(图7)，CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56阴性。PD-L1和PD-1表达与LEC患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤分期等均无相关性(P>0.05，表1)。EBER原位杂交检测结果均呈阳性(图8)。

2.4 基因检测本组11例行基因突变检测，包括RET基因融合、ROS1基因融合、EGFR基因突变、HER-2基因突变、PIK3CA基因突变、BRAF基因突变、KRAS基因突变、ALK基因重排，结果均呈阴性。

3 讨论

LEC是一种罕见且独特的肺癌亚型，好发于较为年轻且非吸烟的东南亚地区和中国的患者，无明显性别差异[6]。WHO(2021)肺肿瘤分型系统将淋巴上皮瘤样癌的名称更改为淋巴上皮癌，并归类于鳞状细胞癌分类目录下[7]，其组织学上与鼻咽癌非常类似，肿瘤免疫微环境中存在大量浸润淋巴细胞。大多数肺LEC患者无明显临床表现，少数患者伴发热、咯血、咳嗽、咳痰及胸闷等症状。肺LEC好发于左下肺叶和右中肺，但很少发生于右上肺[8]。本组41例患者多是通过体检偶然发现肺部结节，仅4例有吸烟史，男女比为1.2 ∶1，发病年龄27～77岁，中位年龄54岁，肿瘤的发生部位多见于右肺下叶(32%)和左肺下叶(27%)，少见于左肺上叶(5%)和左下肺门(5%)。除外肿瘤发生部位，其余临床症状与既往报道相似。

血清肿瘤相关标志物对恶性肿瘤的辅助诊断、治疗和疾病监测具有重要作用。然而，肺LEC中血清肿瘤标志物的特征尚不清楚。肺LEC患者血浆中的循环EBV-DNA含量可预测疾病进展和治疗反应情况，较高的EBV浓度可能与肿瘤进展和癌症分期相关[9]。有学者报道血清NSE和Cyfra21-1水平可能与疾病的活动性相关，可用于监测早期肿瘤复发，因此建议在肺LEC治疗期间进行定期随访[10]。

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表1 41例原发性肺淋巴上皮癌患者PD-L1和PD-1表达与临床病理特征的关系

Qin等[11]发现肺LEC患者的CA125升高率达25.3%(20/79)，这提示CA125升高可能是预测肺LEC的标志物之一。本组病例均在首诊时进行了血清肿瘤标志物检测，1例患者CA199升高，各有2例患者CA125和CEA升高，4例患者NSE升高，11例患者Cyfra21-1升高，其他肿瘤标志物均阴性。

肺LEC的组织病理特征与未分化的鼻咽癌类似，是一种分化差并混有明显淋巴细胞浸润及癌细胞核内存在EBV的独特类型的肿瘤，需与转移性鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤进行区分。有研究发现肺LEC的一些明显的病理形态学特征，包括小灶角化、肉芽肿性炎以及肺泡腔扩散和鳞状扩散模式[12]。本组患者通过鼻咽内镜检查排除了鼻咽部转移性LEC，其中有8例出现肉芽肿性炎、4例出现局灶角化和3例出现肺泡腔播散。免疫组化可为了解不同肿瘤的分化来源等生物学特征提供线索，本组病例表达CK5/6、p40、p63、PD-L1，不表达神经内分泌标志物(Syn、CgA、CD56)和腺上皮标志物(CK7、TTF-1、Napsin A)，所有病例EBER原位杂交均呈阳性，提示肺LEC起源于上皮组织，本质上属于鳞状细胞癌的一种亚型。此外，肿瘤间质淋巴细胞PD-1阳性率达41.46%(17/41)，这提示肿瘤相关微环境中存在着大量的免疫效应细胞。

目前，肺LEC的分子机制和发病机制尚未明确。在整合基因组和转录组分析中发现[13]，肺LEC中肿瘤相关基因锌指和BTB结构域16(zinc finger and BTB domain containing 16, ZBTB16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activated receptors γ, PPARγ)和重组人转化生长因子β受体2(recombinant human transforming growth factor beta receptor 2, TGFBR2)显著下调，同时存在拷贝数变异(copy number variations, CNVs)的丢失，但缺乏NSCLC中常见的驱动基因突变(如EGFR、KRAS和BRAF等)。因此，肺LEC缺乏驱动突变因子可能会使肿瘤细胞的侵袭性降低，并可能导致肺LEC患者的生存率增加。此外，EBV可以促进BART5-3P的表达，TP53突变和PD-L1表达与无瘤生存期(disease-free survival, DFS)相关，这些发现为肺LEC的分子机制研究提供了新见解。本组病例未检测到PIK3CA、RET、ALK、ROS1、EGFR、BRAF、KRAS和HER-2基因突变。与低基因突变率不同，PD-L1在肺LEC中的阳性率达90%以上(37/41)，其中16例呈高表达(16/41, 34.15%)，但PD-L1表达与LEC患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤分期等均无相关性(P>0.05)。本组PD-L1的表达水平高于既往文献报道的数据，但PD-L1表达对肺LEC患者的预后意义存在争议。有研究证实[14]，肺LEC中PD-L1阳性率为75%，并且PD-L1阳性患者有更长的DFS和总生存期(overall survival, OS)。另有研究表明[15]，PD-L1表达与LEC患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤分期、淋巴结转移和OS均无相关性(P>0.05)。

早期肺LEC主要通过手术治疗，晚期常以放疗联合化疗进行综合治疗。虽然肺LEC患者的预后优于其他亚型的NSCLC患者，但仍有部分患者出现治疗耐药性，从而出现局部肿瘤复发和(或)远处转移[16]。对于综合治疗失败的肺LEC晚期患者，目前暂无统一和标准的治疗措施。此外，肺LEC基因突变罕见可能提示靶向治疗的低敏感性，而PD-L1在肺LEC中高表达揭示了在这一亚型肺癌中使用免疫治疗的可能性[17]。并且免疫治疗的有效性可能不仅取决于肿瘤组织中PD-L1表达情况，还取决于肿瘤微环境中是否有足够的免疫效应细胞；肺LEC肿瘤周围间质有丰富的淋巴细胞和浆细胞浸润，这可能是肺LEC患者尽管PD-L1低表达但仍受益于免疫治疗的原因之一[11]。因此，PD-1/PD-L1抑制剂可能是晚期肺LEC患者的有效治疗方式之一，或许将改变晚期肺LEC患者的治疗模式。本组病例均经手术切除病灶，接受新辅助治疗者3例，接受辅助治疗者19例，化疗周期>4程者7例。肿瘤细胞和间质淋巴细胞的PD-1及PD-L1阳性率较高，分别为90.24%、41.46%，这为肿瘤的免疫治疗提供了依据。目前患者均存活且状态良好，其中3例分别出现胸腔、肝和骨转移，并且将继续接受辅助治疗。

综上，肺LEC是一种少见且独特亚型的肺恶性肿瘤，好发于非吸烟的年轻患者，组织学特征与鼻咽癌相似，且与EBV密切相关。因此，诊断肺LEC首先要排除鼻咽等部位的肿瘤转移。由于发病率低和病例信息有限，缺乏标准的治疗模式，肺LEC治疗方式主要通过手术、放疗和化疗。由于肿瘤相关基因突变率低，晚期肺LEC患者不太可能从靶向治疗中获益。PD-1及PD-L1在肺LEC中高表达使得免疫治疗成为肺LEC治疗热点，但仍需进一步的临床研究验证。由于样本量及随访时间有限，未来将开展具有足够长随访时间的多中心研究，以提供更多的证据来确定肺LEC的最佳治疗策略。