透明细胞肾细胞癌组织及四种不同肾细胞癌细胞株中EIF3B的表达及意义

詹鹤琴，常佳俊，袁瞻远，姚晓荷，郝明悦，刘晓利，马 伟，蔡永萍

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，占所有成人恶性肿瘤的2%～3%，占肾脏恶性肿瘤的80%～90%。GLOBOCAN 2020数据库报告了2020年全球新发RCC 431 288例，占全球新发癌症总数的2.2%，RCC患者死亡179 368例，占全球癌症死亡总数的1.8%[1]。RCC早期常无明显症状，约30%患者初诊时已为转移性RCC。透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC最常见的组织学亚型，占RCC的70%～80%[2]。ccRCC对常规放、化疗均不敏感，外科手术是局限性和局部进展性ccRCC患者首选的治疗方式，但手术后仍会发生复发和转移[3]。转移性ccRCC患者预后较差，尽管进行了肾切除术或靶向治疗，其5年生存率仍低于10%[4]。因此，探索ccRCC治疗的有效新靶点，有助于了解其发生、发展的潜在分子机制，对ccRCC治疗及预后评估具有重要的临床意义。

真核翻译起始因子3(eukaryotic initiation factors 3, EIF3)是最大的、结构最复杂的多亚基翻译起始因子，由13个蛋白质亚基EIF3a～EIF3m构成[5]。EIF3亚基在肿瘤的发生和进展中起着重要作用[6]。EIF3B是EIF3关键的支架亚基，参与多种重要的细胞活动，包括细胞周期进程、细胞凋亡、细胞骨架组装、翻译调控等[7]。近年来，随着对EIF3B认识的逐渐深入，人们对其与恶性肿瘤的关系也有了进一步认识。Zhu等[8]研究发现EIF3B在胰腺癌中异常高表达，且与预后不良有关。有学者报道EIF3B在乳腺癌细胞株和组织中高表达，亦与患者预后差相关，而敲除EIF3B表达可抑制细胞周期和增殖[9]。目前，EIF3B在ccRCC中的作用及能否成为ccRCC治疗的新靶点尚不清楚。本研究主要探讨EIF3B在ccRCC及4种不同RCC细胞株中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料通过UALCAN在线网站分别获得TCGA数据库、CPTAC数据库中正常肾组织和原发性ccRCC中EIF3B mRNA和蛋白的表达数据。TCGA数据库中ccRCC样本533例，正常肾组织样本72例；CPTAC数据库中ccRCC样本110例，正常肾组织样本84例。ccRCC临床资料包括患者年龄、性别、AJCC分期、ISUP分级和淋巴结转移情况(表1)。从cBioPortal数据库中下载ccRCC EIF3B mRNA的表达数据，其中234例有完整的临床资料信息和生存信息，用于单因素和多因素Cox回归分析。

表1 透明细胞肾细胞癌患者的临床病理特征[n(%)]

1.2 细胞株正常肾小管上皮细胞株HK-2和RCC细胞株Caki-2、786-O、ACHN、A-498均购自美国模式培养物库(ATCC)，其中Caki-2、786-O明确为ccRCC细胞株，另两种ACHN、A-498为RCC细胞株，未明确亚型。

1.3 主要试剂兔抗人多克隆EIF3B抗体(浓缩型)购于美国Affinity Biosciences公司；兔抗人单克隆β-actin抗体购自中国ZenBio公司；羊抗兔HRP标记二抗购自美国Signalway Antibody公司；RIPA裂解液、Maxima SYBR Green qPCR 预混液均购自美国Thermo Scientific公司；10%SDS、脱脂奶粉、Tween-20、DEPC处理水均购于上海碧云天公司；PVDF膜、ECL发光液均购于美国Millipore公司；TRIzol试剂、M-MLV逆转录酶均购于美国Invitrogen公司。

1.4 方法

1.4.1生物信息学分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)在线网站[10]分析TCGA数据库、CPTAC数据库中正常肾组织和原发性ccRCC中EIF3B mRNA和蛋白的表达差异，并观察EIF3B mRNA和蛋白表达与临床病理特征的关系。Kaplan-Meier Plotter数据库[11]是生存分析领域最经典权威的工具，可评估30 000个基因在21种癌症类型中的表达对生存率的影响。采用Kaplan-Meier Plotter分析EIF3B mRNA表达与ccRCC患者预后关系。从cBioPortal数据库中下载ccRCC中EIF3B mRNA的表达数据，分析EIF3B表达水平、临床病理特征与ccRCC患者预后的相关性。HPA数据库(Human Protein Atlas)[12]是基于蛋白组学、转录组学以及系统生物学数据，不仅收录了肿瘤组织，也包含了正常组织的蛋白表达情况。利用HPA数据库观察EIF3B蛋白在ccRCC中的表达。

1.4.2细胞培养 将装有细胞的培养瓶置于37 ℃、5%CO2培养箱中，HK-2、A-498细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，Caki-2、786-O、ACHN细胞分别使用含有10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基、RPMI 1640培养基、MEM培养基，观察细胞的生长情况，每48～72 h传代后继续培养。

1.4.3实时荧光定量PCR 细胞中的总RNA通过TRIzol试剂提取，操作按说明书进行。采用M-MLV逆转录酶将总RNA转录成cDNA，使用Maxima SYBR Green qPCR预混液对EIF3B mRNA定量检测，反应在ABI 7300系统上进行，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合计40个循环。EIF3B：正向引物5′-CCGGGTCAAC CTCTTTACGG-3′，反向引物5′-GAAGTGCGGTCTC CACTCTC-3′；GAPDH：正向引物5′-TGGGTGTGAAC CACGAGAA-3′，反向引物5′-GGCATGGACTGTGGT CATGA-3′，以GAPDH作为内参。

1.4.4Western blot法 使用RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃、1 000 r/min离心5 min后收集上清。加入SDS-PAGE上样buffer后煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗人EIF3B抗体(1 ∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗涤后加入适当稀释的HRP标记二抗，室温孵育1 h。将膜洗涤3次后在膜上涂布ECL发光液，在Tanon-5200成像系统上观察结果。用兔抗人β-actin抗体(1 ∶2 000稀释)作为内参。

1.5 结果判定

1.5.1实时荧光定量PCR检测结果判定 实验重复3次，通过各样本到达设定的阈值时所对应的扩增循环数(CT值)，采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量，比较各RCC细胞组与正常肾小管上皮细胞组间EIF3B mRNA的平均表达量。

1.5.2Western blot检测结果判定 在Tanon-5200成像系统上出现与目的蛋白大小一致的、清晰的单一条带则为阳性。实验重复3次，采用Image J v1.8.0软件对条带进行定量分析，比较各RCC细胞组与正常肾小管上皮细胞组间EIF3B蛋白的平均表达量。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.00软件进行分析并绘制箱式图，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用方差分析；Kaplan-Meier生存分析采用Log-rank检验方法；应用单因素和多因素Cox回归分析EIF3B表达水平、临床病理特征与ccRCC患者预后的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ccRCC和正常肾组织中EIF3B mRNA的表达利用UALCAN在线网站分析TCGA数据库ccRCC组织(533例)和正常肾组织(72例)中EIF3B mRNA的表达，结果显示EIF3B mRNA在ccRCC中的表达水平高于正常肾组织(P<0.001，图1A)。

2.2 ccRCC中EIF3B mRNA表达与临床病理特征的关系分析EIF3B mRNA表达与ccRCC临床病理特征的相关性，结果显示：与正常肾组织相比，EIF3B mRNA在性别、年龄、AJCC分期、ISUP分级及淋巴结转移亚组中的表达差异具有统计学意义(P<0.01，图1B～F)。

2.3 ccRCC中EIF3B mRNA表达与患者预后的关系采用Kaplan-Meier Plotter分析EIF3B mRNA表达与ccRCC患者预后的关系，结果显示：EIF3B mRNA高表达组ccRCC患者的总体生存率低于EIF3B mRNA低表达组(HR=1.76，Log-rankP=0.000 28，图2)。单因素Cox回归分析显示：AJCC分期、ISUP分级、淋巴结转移、远处转移及EIF3B表达与ccRCC患者的总生存期相关(P<0.01)，而与患者性别和年龄无关。多因素Cox回归分析显示：AJCC分期、ISUP分级、远处转移及EIF3B表达是影响ccRCC患者预后的独立危险因素(P<0.05，表2)。

图1 透明细胞肾细胞癌中EIF3B mRNA表达及与临床病理特征的关系：A.UALCAN在线网站分析EIF3B mRNA在TCGA数据库中533例透明细胞肾细胞癌组织和72例正常肾组织中的表达；B.EIF3B mRNA表达和患者性别的关系；C. EIF3B mRNA表达和患者年龄的关系；D. EIF3B mRNA表达和AJCC分期的关系；E. EIF3B mRNA表达和ISUP分级的关系；F. EIF3B mRNA表达和淋巴结转移的关系；**P<0.01，***P<0.001

表2 影响透明细胞肾细胞癌患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

图2 EIF3B mRNA表达与透明细胞肾细胞癌患者总生存率的关系

2.4 ccRCC和正常肾组织中EIF3B蛋白的表达利用UALCAN在线网站分析CPTAC数据库ccRCC组织(110例)和正常肾组织(84例)中EIF3B蛋白的表达，结果显示：EIF3B蛋白在ccRCC中的表达水平高于正常肾组织(P<0.001，图3A)。与正常肾组织相比，EIF3B蛋白在性别、年龄、AJCC分期、ISUP分级及mTOR通路分子改变亚组中的表达差异具有统计学意义(P<0.05，图3B～F)。在HPA数据库中EIF3B抗体(HPA048983)免疫组化染色结果显示：EIF3B蛋白在ccRCC组织中高表达，阳性信号定位于细胞质和(或)细胞膜，>75%的肿瘤细胞阳性(图4)。

图3 正常肾组织和透明细胞肾细胞癌中EIF3B蛋白的表达及与临床病理特征的关系：A.利用UALCAN在线网站分析CPTAC数据库110例透明细胞肾细胞癌组织和84例正常肾组织中EIF3B蛋白的表达；B.EIF3B蛋白表达和患者性别的关系；C.EIF3B蛋白表达和患者年龄的关系；D.EIF3B蛋白表达和AJCC分期的关系；E.EIF3B蛋白表达和ISUP分级的关系；F.EIF3B蛋白表达和mTOR通路相关分子改变的关系；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图4 HPA数据库中EIF3B抗体(HPA048983)免疫组化染色显示：EIF3B蛋白在透明细胞肾细胞癌组织中高表达，阳性信号定位于细胞质和(或)细胞膜，>75%的肿瘤细胞阳性

2.5 RCC细胞和正常肾细胞株中EIF3B mRNA的表达实时荧光定量PCR结果显示：与正常肾小管上皮细胞HK-2组相比，4种不同RCC细胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498组中EIF3B mRNA的相对表达量均增高，其中ccRCC细胞Caki-2、786-O组中的表达更高(t=10.92，P=0.000 4；t=12.7，P=0.000 2，图5)。

图5 实时荧光定量PCR检测EIF3B mRNA在正常肾小管细胞HK-2和4种不同肾细胞癌细胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中的表达：***P<0.001

2.6 RCC细胞和正常肾细胞株中EIF3B蛋白的表达Western blot结果显示：EIF3B蛋白在正常肾小管细胞HK-2中低表达，而在4种RCC细胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中均高表达，其中ccRCC细胞Caki-2、786-O表达更高(t=14.36，P=0.000 1；t=13.24，P=0.000 2，图6)。

图6 Western blot法检测EIF3B蛋白在正常肾小管细胞HK-2和4种不同肾细胞癌细胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中的表达：**P<0.01；***P<0.001

3 讨论

近年来，ccRCC的发病率呈逐年上升趋势。ccRCC对常规放、化疗均不敏感，且约1/3患者在就诊时已发生转移，因此在治疗上仍面临较大挑战。目前，免疫检查点抑制剂已成为ccRCC患者一个新的治疗选择。尽管这种新兴疗法可在一定程度上提高患者的存活率，但仍有大量晚期ccRCC患者对这一治疗无反应或出现耐药[13]。因此基于ccRCC发病的分子机制，探寻新的预后指标和治疗靶点，对ccRCC患者的预后判断及治疗具有重要的临床意义[14]。

人类EIF3B蛋白是一种主要的支架蛋白，由814个氨基酸组成，在N端具有RNA识别结构域(RRM)[15]。EIF3B通过调控mRNA的翻译起始过程、从而影响蛋白质的合成，最终能够调控细胞的生长。近年有研究表明，EIF3B对多种肿瘤的发生、发展具有重要作用[8-9,16-18]。Tian等[16]研究发现，EIF3B可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，并与非小细胞肺癌患者的疾病进展和预后相关。沉默EIF3B表达可降低骨肉瘤细胞的活性，增加骨肉瘤细胞的凋亡水平，并通过靶向调控TNFRSF21促进骨肉瘤细胞的增殖[17]。Wang等[18]研究表明，抑制EIF3B表达可抑制卵巢癌细胞的增殖，增加卵巢癌细胞的凋亡。目前，EIF3B在ccRCC中作用的研究极少，仅1篇文献报道EIF3B在ccRCC中高表达[19]，EIF3B能否成为ccRCC预后的新指标及治疗的新靶点尚不清楚。

本研究利用UALCAN在线网站分析TCGA数据库ccRCC和正常肾组织中EIF3B mRNA的表达，结果显示EIF3B mRNA在ccRCC中表达增高；且与正常肾组织相比，EIF3B mRNA在性别、年龄、AJCC分期、ISUP分级及淋巴结转移亚组中的表达升高。CPTAC数据库分析结果显示，EIF3B蛋白在ccRCC中的表达水平高于正常肾组织；EIF3B蛋白在性别、年龄、AJCC分期、ISUP分级亚组中的表达也高于正常肾组织。同时，HPA数据库亦证实EIF3B蛋白在ccRCC组织中高表达。上述结果提示：EIF3B可能在ccRCC发生、发展中起重要作用。CPTAC数据库显示：110例ccRCC中有105例(95.5%)存在mTOR通路相关分子的改变，且105例存在mTOR分子改变的ccRCC中EIF3B的表达高于正常肾组织，提示EIF3B在ccRCC中可能通过mTOR信号通路发挥作用。此外，单因素Cox回归分析显示，ccRCC患者AJCC分期、ISUP分级、淋巴结转移、远处转移及EIF3B表达与患者的总生存期相关，而与患者性别和年龄无关；多因素Cox回归分析显示，AJCC分期、ISUP分级、远处转移及EIF3B表达是影响ccRCC患者预后的独立危险因素。Kaplan-Meier Plotter分析结果显示：EIF3B表达对ccRCC患者的总体生存率有影响。EIF3B高表达组ccRCC患者的总体生存率低于EIF3B低表达组，提示EIF3B高表达与ccRCC患者预后不良相关。

为进一步探索EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC中的表达水平，本组选用了4种不同RCC细胞株Caki-2、786-O、ACHN和A-498(其中Caki-2、786-O明确为ccRCC细胞株)和正常肾小管上皮细胞株HK-2。实时荧光定量PCR检测结果显示，EIF3B mRNA在4种RCC细胞中的相对表达量均高于HK-2细胞，其中Caki-2、786-O表达更高。Western blot结果显示，EIF3B蛋白在4种RCC细胞中的表达量增高，尤其是ccRCC细胞Caki-2和786-O。Zang等[19]研究发现，EIF3B蛋白在Caki-2和A-498中高表达。本组结果提示：EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC细胞株中的表达水平与在ccRCC组织中的表达一致，均呈高表达。

综上，EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC组织及细胞株中均呈高表达，且与ccRCC临床病理特征及预后相关，并且存在mTOR信号通路分子改变的ccRCC中EIF3B表达增高，提示EIF3B在ccRCC发生、发展中起重要作用，并可能通过mTOR信号通路发挥其作用。该结果为进一步深入研究ccRCC的分子机制、探寻新的预后指标和治疗靶点提供一定的理论依据。