精子形态畸形相关指数与夫精人工授精结局的关系

杨 岳 洪 洋 胡慧敏 丁彩飞

人工授精是临床上用于治疗不孕症的常用手段，影响其受孕率的因素有很多。研究表明，精子形态畸形可能导致胚胎发育不良、胚胎种植率和怀孕率低以及反复流产[1-2]。精子存在多个部位同时畸形的情况，即多重精子缺陷，相关的评价指标主要有多重异常指数（MAI）、畸形精子指数（TZI）和精子畸形指数（SDI），其中研究者发现MAI 和TZI 与体内生育能力相关[3]，而SDI 与体外受精联系紧密[4]。目前关于这三个精子形态多重畸形相关指标与人工授精临床结局之间的相关性的研究仍较为缺乏。本研究拟探索男性精子形态畸形相关指数与夫精人工授精结局的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 连续选取2020 年2 月—2021 年5月在浙江省中西医结合医院生殖医学科行夫人工授精的夫妇192 对，其中女性年龄（32.16±4.69）岁，男性年龄（34.57±5.19）岁。本研究通过医院伦理委员会审核，伦理批号：【2021】快审（26）号，研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：（1）所有患者按照相关规定行常规术前检查，夫妻双方年龄≤45 岁，双方均无全身性疾病及传染病；（2）女性经子宫输卵管碘油造影检查显示至少一侧输卵管通畅，且通畅输卵管侧有优势卵泡发育，子宫内膜情况良好；（3）正常性生活未避孕至少1 年及以上仍未受孕，双方生殖系统相关检查结果均显示正常。排除标准：（1）年龄＞45 岁或在此年龄阶段无生育要求；（2）生殖器官存在畸形或者先天性性腺发育不全；（3）合并其他器官严重原发病及精神病患者；（4）夫妻任何一方存在未得到充分治疗并转阴的生殖系统感染或性传播疾病；（5）患者人工授精手术后失联，无法追踪妊娠情况。

1.3主要试剂及仪器 试剂与耗材：精子形态快速染液（Diff-Quik 染液）（深圳市博锐德生物科技有限公司，批号20201001），40%与80%密度梯度分离液（SAGE，批号20471648），精子培养液（SAGE，批号20471639），取精杯（BD Falcon 公司，批号9320028），离心管（BD Falcon 公司，批号21220023），玻片；仪器：普通光学显微镜（OLYMPUS，CX31），生物安全柜（Thermo，1300 SERIES A2）。

1.4精子形态分析 严格按照试剂盒说明书制片，使用Diff-Quik 染液进行快速染色。晾干后使用普通光学显微镜的油镜（放大1000 倍）读片，计数至少200 个精子，严格遵循《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[5]的相关要求和规定判断并统计精子形态情况，计算精子形态正常率、MAI、TZI 和SDI。精子形态示例具体见图1：正常精子B；仅头部畸形精子A、G、F、H；仅尾部畸形精子D；头部与中段畸形精子C、J；头部与尾端畸形精子L、K；中段及尾部畸形E；头部、中段及尾部同时畸形I、O、P、M、N；过量残留胞浆精子N。精子形态正常率=正常精子数/精子总数，MAI=缺陷总数/缺陷精子数（统计所有头、中、尾部畸形，多部位畸形可重复计数），TZI=缺陷总数/缺陷精子数（头、中、尾部畸形各记为1，过量残留胞浆也记为1），SDI=缺陷总数/精子总数（头部几种缺陷合并记为1，中部尾部各记为1，过量残留胞浆也记为1）。根据计数结果，精子形态正常率分为四组，具体为≥6%、4%～＜6%、2%～＜4%、＜2%；MAI 分为≥2.00、1.50～＜2.00、1.00～＜1.50 三组；TZI 分为两组，1.50～2.00 和1.00～＜1.50；SDI 分为三组，分别是1.50～2.00、1.00～＜1.50 和0.50～＜1.00。

图1 不同形态精子（Diff-Quik 快速染色法）

1.5行夫精人工授精手术 男方禁欲3～7 天，使用手淫法取精液于取精杯中，将精液置于37℃培养箱中直至完全液化，梯度液平衡至室温，精子培养液放置5%CO2，37℃培养箱培养；吸取1mL 80%的密度梯度液小心加到1mL 40%密度梯度液下方；充分混合液化后的精液，加到40%密度梯度液上方；400g 离心20min，优质精子将集中于试管底部；弃去上层精浆和分离液，用3～4mL 培养液重悬精子沉淀团；再300g 离心5min，弃上清，加入0.4～0.5mL 精子洗液重悬精子沉淀团，获得浓缩的精子悬液，放入37℃的CO2培养箱备用。根据女方具体情况选择自然周期或促排后进行人工授精术，B 超监测到优势卵泡，LH出现峰值，在优势卵泡排出前后将精子悬液注入宫腔，并抬高臀部平躺1h。

1.6判定妊娠 术后10～18 天尿或血β-绒毛膜促性腺激素（β-HCG）值出现阳性结果，35 天左右B 超检测到孕囊、卵黄囊及胎儿心跳搏动确定为临床妊娠，统计各组妊娠率。

1.7统计学方法 应用统计软件SPSS 19.0 分析相关数据，妊娠率作为描述性计数资料，采用卡方检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同精子形态正常率各组临床妊娠率比较 不同形态正常率各组的妊娠率比较，差异无统计学意义（χ2=0.31，P=0.961），见表1。

表1 不同精子形态正常率各组临床妊娠率比较（例，%）

2.2不同精子MAI 各组妊娠率比较 各组间妊娠率比较，差异无统计学意义（χ2=1.86，P=0.402），见表2。

表2 不同精子MAI 各组妊娠率比较（例，%）

2.3不同TZI 各组妊娠率比较 不同TZI 组间妊娠率比较，差异无统计学意义（χ2=0.139，P=0.712），见表3。

表3 不同TZI 各组妊娠率比较（例，%）

2.4不同SDI 各组妊娠率比较 不同SDI 各组妊娠率差异有统计学意义（χ2=8.12，P=0.022），其中1.50～2.00 组和1.00～＜1.50 组之间无差异，但0.50～＜1.00组与前两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 SDI 各组妊娠率比较（例，%）

3 讨论

对于有生育要求的不孕不育症夫妇，临床上常用的辅助生殖技术是人工授精手术，但人工授精受孕成功率一般在8%～22%之间[6]。造成人工授精成功率较低的因素有很多，其中男性因素主要是精液情况和精子质量，精子形态学是评估男性精子质量的重要指标之一，精子的形态畸形会从多方面影响受孕，例如影响精子识别、结合卵子透明带的能力和顶体反应[2]。有研究发现，精子畸形率程度与胚胎发育潜能呈负相关关系，而与受孕后发生早期自然流产风险表现为正相关关系，因此会影响体外授精的成功率[7-8]。有报道显示，MAI、TZI、SDI 在特发性少弱畸形精子症患者的检测中均与其精子中段、尾部异常百分率呈正相关[9]，也有研究表明，SDI 与精子密度、活力与前向运动率之间存在负相关关系，与体外授精成功率也呈负相关关系[4，10]，而对于三者与人工授精临床结局之间的相关性，目前还未有报道。

本研究发现，精子形态正常率≥6%组的妊娠率较其他组略高，但差异无统计学意义；不同MAI 和TZI 各组间也无显著性差异；但SDI 值0.50～＜1.00 组的妊娠率明显增高（P＜0.05）。以上结果说明暂未发现精子形态正常率、MAI、TZI 对不孕患者人工授精术后妊娠率具有预测作用，但SDI 对预测人工授精术后妊娠率具有一定指导意义。这一方面可能由于样本量有限，MAI、TZI 相关分组的样本数存在不足；另一方面也可能由于精子形态正常率只关注正常精子所占总数比例，而MAI、TZI 反映的是畸形精子的缺陷程度，SDI 则可以反映各种缺陷精子占精子总数比例，可代表样本总体的多重缺陷情况，并且SDI 的缺陷精子计数包含对过量残留胞浆的计数，已有研究者发现过量残留胞浆会造成精子功能缺陷进而影响受孕[11]。

综上所述，我们认为SDI 对人工授精术后的妊娠率具有一定的预测作用，鉴于本研究样本量的局限，后期可继续增加样本量，进一步探索精子多重畸形相关指标与人工授精妊娠率的关系，能够有助于临床更好把握适应证，提高人工授精的成功率。