PELP1表达与胃癌演进及预后相关性分析

赵宝山 梁冠盈 许圣洁 乔慧 陈洪霞 马莹 鞠学萍 王麟

胃癌是严重危害人类健康的疾病。在我国，胃癌的发病率和死亡率占消化道恶性肿瘤的首位[1-2]。尽管胃癌发病率、死亡率较高，但胃黏膜上皮细胞癌变是一个逐渐演进的过程，在胃癌发生前常经历不典型增生和肠上皮化生等癌前病变。胃黏膜上皮细胞在向肿瘤细胞演进过程中伴随着基因表达的异常，形成驱动细胞恶性转化的基因动力[3]。为此，寻找胃癌演进过程中异常表达的基因，对于阻断或逆转胃癌癌前病变具有重要的意义。脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(Proline，glutamate and leucine rich protein 1，PELP1)是一种细胞内支架蛋白，为多条细胞内信号转导通路提供分子相互作用支撑平台。最早的功能研究将PELP1归类为雌激素受体辅助调节因子。但近年来的研究发现，PELP1不仅参与雌激素信号转导，同时也参与雄激素、糖皮质激素等其它类固醇激素的信号转导，并且在不同细胞信号通路交叉窜话(Cross talk)中发挥关键作用[4]。PELP1具有癌基因的特性，在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中均有异常表达和分布，广泛参与多种肿瘤的发生、发展、转移和耐药形成过程[5]。有研究显示，PELP1在胃癌组织中也有异常表达[6]，但PELP1表达与胃癌演进以及预后的关系尚未见报道。为此，本研究观察了胃癌演进不同阶段PELP1表达的变化以及胃癌中PELP1表达与患者生存预后的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例与样本

选择哈尔滨医科大学附属第五医院2016年6月—2020年8月期间胃镜下活检取材低级别不典型增生胃组织标本48例、高级别不典型增生组织标本28例、手术切除取材癌旁正常胃组织标本39例(距胃癌组织≥5 cm)、胃癌组织标本77例，共计192例。入组病例存档HE染色切片经2位病理医生再次阅片确认诊断。患者一般情况、临床病理参数等相关信息提取自存档病历。所有患者在组织取材时均未经任何放化疗。各组间患者年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。本研究方案已经哈尔滨医科大学大庆校区伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学染色

入组病例存档蜡块制成4 μm厚组织切片，常规脱腊水化；pH6.0柠檬酸缓冲液中微波加热20 min进行抗原修复，3%过氧化氢-甲醇溶液消除内源性过氧化物酶，兔抗人PELP1抗体(1∶200)4℃孵育过夜；后续步骤按照中杉金桥小鼠/兔增强聚合物法检测系统说明书要求进行；DAB显色；苏木素复染；脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察。

由2名经验丰富的病理医生对PELP1免疫组化染色进行双盲评分。评分采用H-Score法，即：每张切片随机选取5个200×高倍镜视野进行观察，以阳性对照和阴性对照切片为标准，将每个视野中细胞着色强度判定为0、1、2、3四个等级，再乘以该视野中阳性细胞百分比，获得一个0～300的H-Score值；每张切片计算2名医生、5个视野的H-Score平均值作为H-Score终评分；H-Score终评分<5记为阴性，≥5且<170记为中等阳性，≥170记为强阳性。

1.3 生物信息学分析

通过在线癌症生存分析工具Kaplan-Meier Plotter(http：//kmplot.com)分析PELP1表达(Affymetrix ID：215354_s_at)与胃癌患者总生存期(Overall survival，OS)、首次进展前生存期(Survival before the first progression，FP)和进展后生存期(Post progression survival，PPS)之间的关系。Kaplan-Meier Plotter使用GEO、EGA和TCGA数据库的基因表达数据和生存信息[7]。探针参数设定为“Only JetSet best probe set”；分割点参数选择“Median”；入组数据质量控制设置为“exclude biased array”；其他参数选择默认选项。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。TCGA基因表达数据库中正常胃组织与胃癌组织PELP1 mRNA表达水平的比较采用独立样本t检验；多组间PELP1蛋白表达水平比较采用Kruskal-Wallis检验；两组间PELP1蛋白表达水平比较采用Mann-WhitneyU检验；Kaplan-Meier Plotter系统使用Kaplan-Meier 法进行单因素分析并绘制生存曲线，生存曲线的比较采用Log-rank检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

图1 PELP1 mRNA在正常胃组织和胃癌组织中的表达Figure 1 PELP1 mRNA expression in normal gastric and gastric cancer tissues

2 结果

2.1 胃癌演进过程中PELP1表达水平的分析

比较TCGA基因表达数据库中正常胃组织与胃癌组织PELP1 mRNA表达水平，结果显示，胃癌组织中PELP1 mRNA表达显著高于正常胃组织(P<0.001)(图1)。免疫组化检测结果显示，PELP1阳性表达主要分布于正常胃黏膜上皮细胞、不典型增生上皮细胞、胃癌细胞细胞核(图2)。从正常胃黏膜上皮细胞、低级别不典型增生、高级别不典型增生向胃癌演进过程中，PELP1表达水平逐渐升高，差异具有统计学意义(表1)。Spearman相关性分析结果显示，胃癌演进与PELP1表达呈弱相关(r=0.300，P<0.001)。

图2 PELP1蛋白在正常胃组织、低级别不典型增生、高级别不典型增生、胃癌组织中的表达(200×)Figure 1 PELP1 protein expression in normal gastric，low-grade AH，high-grade AH，and gastric cancer tissues(200×)Note：A.The moderate expression of PELP1 in normal gastric tissues；B.The moderate expression of PELP1 in low-grade AH tissues；C.The strong expression of PELP1 in high-grade AH tissues；D.The strong expression of PELP1 in gastric cancer tissues.Bar=50 μm.AH for atypical hyperlasia.

表1 PELP1表达与胃癌不同演进阶段相关性[n(%)]

2.2 胃癌组织中PELP1表达与肿瘤临床病理参数相关性分析

将胃癌中PELP1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、肿瘤分化程度、肿瘤临床分期做相关性分析，结果显示，胃癌中PELP1表达与淋巴结转移、肿瘤大小、高临床分期呈正相关，与患者性别、年龄、肿瘤分化程度无相关性(表2)。

表2 胃癌中PELP1表达与临床病理参数相关性[n(%)]

2.3 胃癌组织中PELP1表达与患者生存预后相关性分析

采用在线癌症生存分析工具Kaplan-Meier Plotter对胃癌组织中PELP1表达水平与患者OS、FP、PPS做相关性分析，结果显示，PELP1高表达组患者5年和10年OS、FP和PPS均显著低于PELP1低表达组患者(图3)。

图3 胃癌中PELP1表达与患者预后的关系Figure 3 The correlation between PELP1 expression and prognosis of patients with gastric cancerNote：A.The correlation between PELP1 expression and 5-years OS of patients；B.The correlation between PELP1 expression and 5-years FP of the patients；C.The correlation between PELP1 expression and 5-years PPS of the patients；D.The correlation between PELP1 expression and 10-years OS of patients；E.The correlation between PELP1 expression and 10-years FP of patients；F.The correlation between PELP1 expression and 10-years PPS of patients.

4 讨论

胃癌前病变主要包括胃黏膜上皮不典型增生和肠上皮化生。及早识别胃癌前病变，并适当进行胃镜监测和随访，可提高早期胃癌的检出率，降低病死率。胃癌前病变的危险因素包括感染因素、饮食因素、环境因素及自身因素[8]，在这些危险因素的作用下，胃黏膜上皮细胞恶性转化，逐渐向胃癌细胞演进。部分癌基因的异常高表达和抑癌基因的失表达是胃癌演进过程中一个显著的遗传特征[9]。

PELP1基因定位于染色体17p13.2，蛋白由1 130个氨基酸残基组成，计算分子量为120 kD。最早对于PELP1的认识将其归类为雌激素受体辅助调节因子，在雌激素的基因组和非基因组信号转导过程中发挥重要作用。更多的研究发现，PELP1不仅参与雌激素、雄激素和糖皮质激素等类固醇激素信号转导过程，在一些非激素依赖性肿瘤的发生发展过程中，PELP1同样扮演着癌基因的角色。已有研究显示，PELP1是一种支架蛋白，分子结构中包含多个可与不同转录因子或核受体相互作用的基序(Motif)及结构域，为信号转导分子间交叉串话提供分子平台[10]。PELP1 可以通过调节诸如转录因子激活蛋白1(Activator Protein 1，AP 1)、核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、信号转导和转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、四个半LIM结构域2(Four and a half LIM domains protein 2，FHL2)等转录因子调控下游靶基因的表达，也可以直接招募染色质修饰剂组蛋白脱乙酰酶2(Histone deacetylase 2，HDAC2)来调节靶基因的转录[11]。PELP1也参与了胃癌的发生发展过程，但其在胃癌演进不同阶段的表达变化尚未见报道。本研究表明，在胃黏膜上皮细胞经过低级别不典型增生、高级别不典型增生向胃癌演进过程中，PELP1表达水平逐渐升高。这一结果与PELP1的癌基因特征一致。有研究表明，在正常大鼠肾脏上皮细胞和小鼠纤维母细胞中过表达PELP1可造成细胞恶性转化，使细胞获得更强的集落形成和非接触性生长的能力[10]。同样，过表达PELP1也可以通过激活细胞周期素D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDK)、成视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，pRb)等细胞周期相关蛋白促使乳腺上皮细胞异常增生[12]。本研究结果提示，PELP1在胃黏膜上皮细胞中异常表达可能也发挥着恶性转化驱动基因的作用。

转移和复发是导致恶性肿瘤难治的关键因素。对PELP1的生物学功能研究表明，PELP1可以通过增强肿瘤细胞运动性、诱导分泌基质金属蛋白酶、降低细胞间黏附分子表达等途径增强肿瘤细胞侵袭转移能力[13]。本研究结果显示，在胃癌中，PELP1表达与淋巴结转移、低分化肿瘤、高临床分期有关，提示PELP1在胃癌的侵袭转移中可能也发挥着重要的作用。异常表达的基因往往也可能成为判断肿瘤预后的标志物。在乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、子宫内膜癌[16]、神经胶质瘤[17]、结直肠癌[18]等恶性肿瘤中，高表达PELP1是患者总生存期和无进展生存期缩短的独立风险因素。本研究结果显示，在胃癌中，PELP1表达与患者总生存期、首次进展前生存期和进展后生存期呈显著负相关。表明在胃癌中PELP1异常高表达也是提示肿瘤预后不良的一个重要指标。

此外，PELP1也可能成为胃癌的候选治疗靶点。先前的体外实验结果表明，通过小RNA干扰技术(RNAi)降低PELP1的表达可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭，逆转肿瘤细胞化疗耐药性[12，19]。但由于毒性、递送途径、脱靶效应等问题，基于RNAi开发针对PELP1的靶向药物还存在诸多的应用瓶颈[20]。Ravindranathan等[21]报告开发出一种稳定无毒的新型小分子肽类化合物，可以选择性破坏PELP1与其内源性分子之间的相互作用，对前列腺癌细胞表现出良好的增殖抑制效果。这一发现为拓展针对PELP1的靶向治疗创造了广阔的前景，也为胃癌的治疗提供了新的可能手段。

综上所述，本研究为探讨PELP1在胃癌诊断与治疗中的临床意义提供了一定的参考依据，但也存在缺少来源于临床实际样本的生存分析数据、缺少多因素生存分析数据、缺少深入的机制探讨等不足。上述问题还需在今后的研究中进一步充实、完善，以期为阐明PELP1在胃癌诊断治疗中的意义提供更多有价值的理论基础和应用依据。