成熟葡萄果实高质量总RNA提取方法的建立

闫冬梅，薛美昭，仪慧兰，郝丽宏，乔嘉欣

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西大学环境与资源学院，山西 太原 030006；3.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619）

葡萄（Vitis viniferaL.）是我国重要的经济作物，其浆果发育和采后生理直接影响着果实的品质、产量和货架期，因此，研究葡萄果实品质形成、采后衰老及品质劣变的分子机制具有重要意义。高质量的RNA 是后续进行RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、CDS扩增、转录组测序等分子生物学研究的必要前提。但因葡萄果实富含多糖多酚等次生代谢物质，难以获取高质量的RNA，制约了上述分子机制的研究进程。其中，酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响RNA 的分离纯化[1-2]。多糖的理化性质与RNA 相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难将它们分开[3]。随着贮藏时间的延长，葡萄果实中总酚等次生代谢物的含量也随之增加[4]，使得RNA的提取更加困难。

目前，已经发展了多种RNA 的提取方法，如异硫氰酸胍法、热硼酸法、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法 等[5-7]。其中，异硫氰酸胍能强烈抑制组织及提取液中RNase 的活性，但异硫氰酸胍法仅适用于次生代谢物含量少的组织材料[8-9]；SDS在常温下就有较强的裂解效果，结合酚、氯仿抽提，SDS法可以有效去除植物组织中的多糖[3]；热硼酸法中，硼酸能与酚类物质形成复合物，从而避免多酚的干扰，蛋白酶K 和醋酸钾分别能除去蛋白质和多糖，但是该法所需药品多、价格高、操作较复杂[10]；CTAB 在高离子浓度溶液中能与蛋白质、多酚和中性多聚糖共沉淀，同时使核酸溶解达到分离核酸的目的，CTAB 法提取效率高，产物纯度高，且所需药品简单，是提取富含多糖多酚植物组织总RNA较有效的一种方法[11]。

基于CTAB法提取RNA的原理，近期国内外已报道有适用于葡萄多种组织的RNA提取方法[12-14]，但从葡萄成熟果实中获取高质量总RNA 的方法还鲜有报道。本研究建立了改良CTAB 法，提取成熟的玫瑰香葡萄果实总RNA，得到高质量的RNA，并顺利完成了RT-PCR、qRT-PCR 和CDS 扩增等试验，该方法通过从完全成熟、富含花色素的葡萄鲜果和贮藏果实组织中提取总RNA，旨在为葡萄分子生物学的研究提供可靠的技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

从葡萄园中采摘商业成熟的玫瑰香葡萄（Muscat Hamburg）果穗，立即运至试验冷库（（-1.0±0.5）℃）。剔除有外伤的颗粒，按5 kg 一箱分装，预冷12 h 后放入SO2保鲜剂，扎紧袋口。根据课题组前期研究，在采后经SO2保鲜的60 d内，玫瑰香葡萄果实的总酚含量呈上升趋势，糖含量维持在较高水平[4，15]，故分别取贮藏0 d 和60 d 的葡萄果粒若干，经液氮速冻处理后存于-80 ℃冰箱备用。

CTAB、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K40）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巯基乙醇（分析纯）（北京索莱宝科技有限公司）；二乙基焦碳酸酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）、亚精胺、酸性酚（分析纯）（上海生工生物工程股份有限公司）；氯化钠（NaCl）、乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇（分析纯）（天津市天力化学试剂有限公司）；EasyScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒、EasyTaqDNA Polymerase 试剂盒、EasyPureQuick Gel Extraction Kit 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 试剂盒法提取总RNA 购买TransGen 公司的TransZolUp 试剂盒（试剂盒A）和TransZolPlant试剂盒（试剂盒B），GeneAll公司的RibospinTMSeed/Fruit试剂盒（试剂盒C），按产品说明书中的方法提取葡萄果皮总RNA。

1.2.2 改良CTAB法提取总RNA 本研究建立的改良CTAB法，RNA提取缓冲液用0.1%DEPC水配制，各组分终质量浓度为2%（w/V）CTAB，2%（w/V）PVP-K40，0.1 mol/L的Tris-HCl（pH值8.0），0.1 mol/L的EDTA（pH 值8.0），2.5 mol/L 的NaCl，0.5 g/L 的亚精胺。配制完成后，121 ℃灭菌60 min。使用前加入1.5%的β-巯基乙醇。

取0.1 g 葡萄果皮在液氮中研磨成粉末状，迅速移入离心管内，加入1 mL 经65 ℃预热的提取缓冲液，剧烈振荡混匀，65 ℃孵育10～20 min。加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V），涡旋混匀，于8 500 r/min 离心15 min（抽提2 次）。取上清，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4 ℃放置0.5～1.0 h，于8 500 r/min 离心30 min；去上清，75%乙醇（DEPC 水配制）清洗沉淀2 次，室温下风干，加入500 μL的DEPC水，得到核酸粗提物。

之后，加入等体积的酸性酚-氯仿（5∶1，V/V），涡旋混匀，于14 000 r/min 离心10 min（抽提2 次），取上清加入0.1倍体积的5 mol/L NaCl溶液和1.1倍体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V），涡旋混匀，于14 000 r/min离心10 min。取上清，加入等体积的异丙醇，混匀后于4 ℃放置0.5～1.0 h，于8 500 r/min离心30 min；去上清，75%乙醇清洗沉淀2次，室温下风干，加入20～30 μL DEPC水溶解，得到总RNA样品。

RNA 提取过程中所用DEPC 水体积分数均为0.1%，离心均在4 ℃下进行。

1.2.3 RNA 质量检测 取2 μL 总RNA 样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，90 V恒压电泳15 min后，用凝胶成像系统观察电泳条带，分析RNA的完整性。取2 μL 总RNA 样品，使用多功能酶标仪检测RNA的A260/A280、A260/A230及其质量浓度。

1.2.4 RT-PCR检验 根据试剂盒EasyScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix 的操作说明将改良CTAB 法提取的RNA 合成cDNA 第1 链。以得到的cDNA 为模板，按照EasyTaqDNA Polymerase 说明书进行半定量PCR，反应体系20 μL。扩增基因包括内参基因Actin2，病程相关蛋白基因CHI3、CHI1b、GLU、PR1和PR6，引物序列如表1 所示。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1 内参基因及抗病相关基因的引物Tab.1 Primers for internal reference gene and disease resistance related genes

1.2.5 qRT-PCR 检验 根据试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 的操作说明将改良CTAB 法提取的RNA 反转录合成cDNA 第1 链，之后用SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit 试剂盒进行qPCR 扩增。检测内参基因Actin7（上游引物：CTTGCATCCCTCAGCACCTT；下游引物：TCCTGTG GACAATGGATGGA）的表达情况，每组重复4次。

1.2.6 葡萄基因CDS 的扩增 以1.2.4 中合成的cDNA 为模板，依据NCBI 数据库中葡萄VvMYBPA1基因编码区序列，设计合成引物（上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATG GGCAGAGCACCTTGT；下游引物：GGGGACCACTT TGTACAAGAAAGCTGGGTAAATGAGTAGTGATTC GGC），使用高保真克隆酶进行PCR 扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测无误后，用EasyPureQuick Gel Extraction Kit 回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 总RNA的完整性

琼脂糖凝胶电泳是检验RNA 完整性的常规方法。试验结果显示，试剂盒A和试剂盒B的提取物中没有检出RNA条带（图1-A、B）；试剂盒C提取的葡萄RNA 有着极浅的28S 和18S 条带（图1-C）；用改良CTAB法提取成熟葡萄果实中的RNA，得到贮藏初期和贮藏60 d 葡萄果实总RNA，具有典型的28S、18S和5S带型，且条带未见弥散现象，其中28S条带亮度约为18S 的2 倍，没有蛋白和DNA 污染（图1-D）。结果表明，该改良CTAB 法可以高效提取成熟葡萄果皮的总RNA。

2.2 总RNA的纯度与得率

因试剂盒A 和试剂盒B 没有得到有效的RNA产物，故只对另2 种方法提取的RNA 进行核酸定量。一般来讲，高质量RNA 的A260/A280在1.8～2.0，说明样品基本没有降解，且不受蛋白或苯酚等污染[16]；A260/A230大于2，说明样品较少受多酚、多糖、有机溶剂等污染[14]。从表2 可以看出，试剂盒C 提取的葡萄总RNA质量浓度均小于10 ng/μL，得率仅有1.5 μg/g 左右，A260/A280小于1.8 且A260/A230远小于2，说明此法RNA 得率低，难以避免其他杂质的污染。用改良CTAB 法提取的葡萄总RNA 质量浓度均大于400 ng/μL，得率均大于85 μg/g，A260/A280在1.8～2.0 且A260/A230大于2，结果表明，该改良CTAB法提取效率高，所提RNA质量良好，质量浓度能够满足后续反转录的需求。

表2 不同提取方法得到葡萄果皮总RNA的质量Tab.2 The quality of total RNA extracted from grape skins by different methods

2.3 RT-PCR 和qRT-PCR 扩增检测RNA 的有效性

将改良CTAB法提取的RNA进行反转录，并利用RT-PCR 和qRT-PCR 验证其可用性。不同贮藏时期葡萄的cDNA 模板均成功扩增出了包括内参基因在内的6 个基因，条带清晰单一，大小与预期一致（图2-A）。同时，进行qPCR 扩增后都能出现对应的扩增曲线，且融解曲线为单峰（图2-B、C），结果表明，改良CTAB 法得到的RNA 质量良好，能够用于RT-PCR和qRT-PCR分析。

2.4 VvMYBPA1基因CDS的扩增结果

获得基因完整的编码序列是研究基因功能的重要前提。VvMYBPA1基因CDS的扩增结果如图3所示。

从图3可以看出，以获得的不同贮藏时期的葡萄cDNA 为模板，均成功扩增出了目的片段，其大小约为1 000 bp，与预计的片段大小861 bp 接近。测序结果显示，该片段为VvMYBPA1的CDS全长序列，表明本研究建立的改良CTAB法提取的RNA完整性较好，可用于葡萄基因CDS的扩增。

3 结论与讨论

RNA 的提取是现代分子生物学研究的基础。葡萄因富含多糖、多酚类物质，难以获取高质量的RNA，尤其是在成熟葡萄果实中，这一难题限制了许多研究人员。本研究建立了一种简便易行、效果良好的总RNA提取方法，有效解决了从富含多糖、多酚等次生代谢物质的成熟葡萄果实中提取总RNA的难题。

葡萄作为一种浆果型水果，用于鲜食、酿酒、榨汁、晾干等，果实品质直接影响着其经济价值。随着葡萄果实的发育和成熟，果实中积累了丰富的糖类、花青素、单宁等风味物质[17-18]。而在采后贮藏过程中，SO2类保鲜剂能够有效延缓葡萄果实的生理衰老[4]，迄今为止的研究还没有找到更好的保鲜方式。因此，提取葡萄果实的RNA 以研究果实品质形成、采后生理和保鲜机制十分必要。

为获得高质量的葡萄果实总RNA，国内外研究人员陆续进行了一些尝试。基于常规RNA 提取方法，通过调整乙醇、醋酸钾、PVP、β-巯基乙醇等关键药品的添加时间和添加剂量，成功提取出了毛葡萄[19]、黑皮诺[10]、山葡萄[20]等品种的果实总RNA。其中，改进后的CTAB 法RNA 得率最高。与之相比，本研究建立的改良CTAB 法中减少了山梨醇洗液清洗、醋酸钾沉淀、氯化锂沉淀、DNase 处理等步骤，在减少操作时间的同时降低了提取成本；在提取缓冲液中增加了亚精胺和PVP，提高了RNA的质量浓度和纯度。本研究建立的改良CTAB 法RNA产率均在85 μg/g 以上，RNA 样品纯度高、完整性好，成功检测了葡萄内参基因和5个病程相关蛋白基因转录，结果与前人一致[4，21]，也成功用于CDS的扩增，为相关研究提供了前期基础。

我们尝试用试剂盒提取，按照操作指南3种不同试剂盒均没有得到可用的玫瑰香葡萄果实总RNA，包括声称适用于植物组织的TransZolPlant和适用于水果组织的RibospinTMSeed/Fruit。而本研究建立的改良CTAB法既能得到高质量的总RNA，还降低了试验成本。

本研究所建立的改良CTAB 法的裂解液中包括CTAB、PVP、亚精胺、β-巯基乙醇及高浓度的NaCl。亚精胺作为RNase 抑制剂，有效地保证了RNA 的完整性[22-23]。可溶性PVP 能与酚类物质充分结合形成螯合物[24]，并通过氯仿抽提将其除去，有效阻止了多酚的干扰[11]。同时，在预热的提取液中加入强还原剂β-巯基乙醇，可与PVP 协同作用抑制酚类物质的氧化[25-26]。提取液中NaCl 的浓度为2.5 mol/L，较高的盐浓度会造成溶解度差异，使CTAB 与多糖形成复合物沉淀，从而有效去除多糖[27]。同时，利用酸性水饱和酚纯化核酸粗提物，RNA 被分配于水相，DNA 和蛋白质被分配于有机相[28]，既能最大限度地去除与RNA 共沉淀的DNA，又能清除残留的蛋白质与多糖。

此外，用本研究报道的改良CTAB 法从玫瑰香葡萄花蕾、幼叶、成熟叶片及成熟红提葡萄果实中提取到了高质量的RNA[29]。说明本方法适用于不同品种葡萄的多种组织，但是否适用于其他多酚、多糖的植物组织材料，仍需要继续验证。

总之，本试验所建立的RNA 提取方法成本低、稳定性好，所得样品纯度高、完整性好，适用于后续RT-PCR、qRT-PCR、CDS 扩增等工作，是一种理想的提取葡萄成熟果实总RNA的方法。