硬粒小麦与粗山羊草人工合成六倍体冬小麦新种质研究

左静静，闫贵云，王 敏，左 敏

（山西农业大学农学院，山西 太原 030031）

小麦（Triticum aestivumL，AABBDD，2n＝6x＝42）是世界上主要的粮食作物之一，播种面积和产量均居世界第一，且是世界35%人口的主要粮食[1]。在小麦进化过程中，只有极少数栽培二粒小麦与粗山羊草通过天然杂交形成了六倍体小麦，大大降低了六倍体小麦的遗传多样性，产生了小麦的“进化瓶颈”[2-4]。20世纪70年代以来，半矮秆高产小麦品种的育成和大面积推广，替代了变异类型丰富的、适应性好的小麦地方品种。这种长期人为的定向选择育种，加速了小麦群体遗传多样性的散失和各种病害的加重，而长期的小麦品种间的杂交育种，使其遗传基础愈来愈窄，遗传变异愈来愈小[5-7]。为了丰富小麦遗传基础，迫切需要从小麦原始种和小麦野生近缘种中向栽培小麦导入优异基因。目前，提高小麦遗传多样性已成为小麦遗传育种的一个重要任务[8]。山羊草属（Aegilops）是和小麦属（Triticum）亲缘关系最近的一个属，而粗山羊草（Aegilops tauschii（Coss.）Schmal DD，2n＝14）是和小麦最近的种之一，粗山羊草与普通小麦的D染色体组完全同源，可发生遗传物质的自由重组和交换，二者杂交无负遗传效应。粗山羊草含有丰富的抗病、抗虫、优质亚基、耐旱、耐寒及耐盐等优异基因，其遗传多样性远比小麦的D染色体组丰富[9]。硬粒小麦（Triticum durum）又称通心粉小麦，染色体组型为AABB，含有锈病、白粉病、黑穗病、黄矮病（BYDV）、纹枯病、麦蝇等多种病虫害的抗源[10]。因此，硬粒小麦和粗山羊草都是用来改良普通小麦非常好的选择。

粗山羊草和硬粒小麦合成双二倍体，在国外主要是由国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）研究并合成，各科研院所和大学所使用的都是来自CIMMYT的双二倍体。目前，国内外研究者的更多注意力在粗山羊草的基因组研究、优质亚基的克隆及抗病性鉴定和基因推导，还有细胞遗传学及育性研究。基因组研究、优质亚基的克隆、抗病性鉴定和基因推导、细胞遗传学及育性研究将是未来一定时期的主要研究动向[11]。在育种方面的研究已开始起步，如四川省农业科学院20世纪末从CIMMYT引进硬粒小麦-粗山羊草双二倍体，育成了川麦42[12]。山东农业大学也利用董玉琛院士等合成的双二倍体开始了初步育种研究[13]。

现有技术手段一方面还没有适合在我国北方冬麦区和黄淮海冬麦区使用的合成麦和合成方法，来自CIMMYT的合成小麦大多是春性的，不适宜我国冬麦区育种使用，且合成过程中合成麦的成胚率成苗率不高[14]。另一方面，有团队的合成麦是利用带自然加倍基因的硬粒小麦（Langdon）和粗山羊草合成，母本的选择局限于Langdon一种，遗传信息存在局限性[15]。

本研究为解决现有合成小麦均为春性小麦，在冬麦区不适用，遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题，通过硬粒小麦与粗山羊草人工合成冬性六倍体小麦，旨在建立一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

配置杂交组合的母本为四倍体硬粒小麦170、153、172、176、159、175、145、149、141、155、149、182、178、184、157、159、硬1、硬3、硬6、硬8、硬9、硬12，父本粗山羊草分别为Y57、Y168、Y126、Y205、Y207、Ae35、Ae46、C7、MO3035、MO5035、RM0183。材料由中国国家种质库提供，山西农业大学农业基因资源研究中心保存。其中，四倍体硬粒小麦为山西农业大学农学院小麦新材料课题组收集的春性硬粒小麦且无法自然加倍，经多年田间鉴定筛选出的越冬性相对较好、抗逆性、品质优良的材料；粗山羊草均为冬性，经鉴定抗逆性较好的材料。

培养基Ⅰ：pH 值为5.8～6.4，蔗糖40 g/L，AgNO310 mg/L，H2SO38 mg/L，KH2PO43 g/L，2，4-D 100 mg/L。

培养基Ⅱ：1/2 MS培养基。

培养基Ⅲ：在1/2 MS 培养基中加入2 mg/L 的2，4-D。

培养基Ⅳ：在1/2 MS 培养基中加入3 mg/L 的6-BA和0.1 mg/L的NAA。

1.2 试验方法

试验中的实验室部分在山西农业大学农学院小麦新材料实验室完成，大田部分设在山西农业大学东阳试验基地，所在生态区为国家北部冬麦区。

1.2.1 播种 选取硬粒小麦和粗山羊草进行田间播种，其中，硬粒小麦和粗山羊草的播量比为2∶1，硬粒小麦分3期播种，每期间隔3～5 d，粗山羊草在硬粒小麦播种第1期的时候播种。

1.2.2 杂交授粉 根据确定的杂交组合，在母本群体内选择典型、健壮植株的主茎穗（刚抽出叶鞘、花药呈绿色）进行去雄、套袋，去雄后48～72 h，用新采集的粗山羊草的花粉授粉并套袋。

1.2.3 幼胚拯救 授粉24 h后，将硬粒小麦植株穗下30～40 cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30 s后，插入液体培养基Ⅰ中培养，培养条件为：温度21～25 ℃，培养湿度80%，光照强度1 500～2 500 lx，光照时间8 h/d，培养14 d后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；在超净台上剥离灭菌后籽粒的幼胚并接种于培养基Ⅱ上培养，培养条件为：温度21～25 ℃，光照强度1 500～2 500 lx，光照时间12 h/d；发育不良的幼胚接种于培养基Ⅲ中，待幼胚发育正常后转入培养基Ⅱ中，如在培养基Ⅲ内继续不良发育的幼胚转入培养基Ⅳ中，在培养基Ⅳ中的幼胚发育正常后转入培养基Ⅱ。

1.2.4 春化培养 待幼胚长至10～15 cm 时，将幼苗置于人工培养箱进行春化培养30～35 d，培养条件为：昼夜温度10～15 ℃/0～4 ℃，日间光照12 h，光照强度1 000～2 000 lx。

1.2.5 染色体加倍 当日平均气温低于10 ℃时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚；当日平均气温超过10 ℃时，揭去塑膜；当幼苗长出2～3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一个直径为10～15 cm 的小坑，露出1/2 的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径10 cm的小烧杯中，然后用吸管注入体积分数为0.1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8 h后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；14 d后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获，期间定点观察并统计越冬前后的死亡株数。

1.2.6 染色体数目鉴定 采用醋酸洋红染色法观察合成小麦染色体F1数目[16]。合成麦种子用75%的酒精消毒30 s，22 ℃左右用水浸泡24 h 至种子露白，置于铺有湿润吸水纸的培养皿中，腹沟向下，（22±2）℃培养12 h，1～4 ℃培养12 h，交替培养，待根长至1.5～2.0 cm时，剪下根尖，置于0～4 ℃的冰水混合物中预处理24 h，用卡诺固定液固定24 h，1 mol/L的HCl恒温（60 ℃）水解8 min，无菌水冲洗3～4次，洋红染液中染色24 h，再用45%冰醋酸压片，用OLYMPUS IX51-A12PH观察记录染色体数目。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2017 和SPSS 19.0 进行统计分析。

对33 个组合的成胚率、成苗率、平均成活率、平均加倍率和死株率进行统计。

2 结果与分析

2.1 合成麦成胚率分析

以硬粒小麦与粗山羊草杂交，授粉后13 d统计杂交穗的结实率。由表1 可知，33 个杂交组合以157/C7的成胚率最高，为100%，176/Y168的成胚率最低，为34.29%。33 个杂交组合的平均成胚率为69.07%。成胚率在80%～100%的组合有6个，分别为182/C7、145/Ae35、178/MO3035、145/Y168、141/C7、157/C7，成胚率在70%～80%的组合有10个，成胚率在60%～70%的组合有10个，成胚率在50%～60%的组合有6 个，成胚率在50%以下的只有1 个组合，即176/Y168。

表1 杂交组合成胚成苗加倍及越冬性情况Tab.1 Frequencies of embryos，percentages of plantlets，rate of chromosome doubling by crossing durum wheat with Aegilops tauschii

续表1 杂交组合成胚成苗加倍及越冬性情况Tab.1 （Continued）Frequencies of embryos，percentages of plantlets，rate of chromosome doubling by crossing durum wheat with Aegilops tauschii

2.2 合成麦成苗率分析

由表1 可知，33 个杂交组合中，以157/C7 的成苗率最高，为85.71%，176/Y168 的成苗率最低，为28.57%，33 个杂交组合的平均成苗率为55.08%。合成麦成苗率较高的5个组合分别为：157/C7、182/C7、141/C7、145/Y168、182/Y168。合成麦成苗率低于40%的组合有5个，分别为：176/Y168、175/Ae35、159/Y168、159/Ae46、153/Ae35。

2.3 加倍率分析

从表1可以看出，33个杂交组合的加倍率均处于较高的水平，其中，染色体加倍处理植株后有7个组合的加倍率均为100%，即176/Ae35、175/Y168、182/Y205、159/Y207、157/C7、硬9/RM0183、硬8/RM0183，33个杂交组合平均加倍率为85.40%，超过平均加倍率的组合有19个。加倍率最低的组合为141/C7，其加倍率为53.33%。

2.4 合成麦越冬性分析

从表1 可以看出，33 个杂交组合中，153/Ae35的死株率最低，为1.90%，141/C7 的死株率最高，为54.80%。33个杂交组合中27.27%的杂交组合死株率低于5%，共有9个，分别为：153/Ae35、172/Y168、176/Ae35、175/Y168、155/Y205、182/Y205、184/C7、157/C7、硬9/RM0183，这些组合可以在试验所在的生态区正常越冬。死株率高于5%的组合占比72.73%，共24个，这些组合在试验所在的生态区越冬性差，不适宜在北部冬麦区种植。由此可见，人工双二倍体在北部冬麦区表现出较弱的越冬性。

2.5 合成麦大田长势及籽粒情况

本试验对加倍的33个合成麦的F1种子根尖细胞染色体数目进行了鉴定，均为2n＝42（图1）。在33 个合成组合中有9 个顺利越冬，其大田长势良好，并且表现出了很强的分蘖性和较高的结实率。157/C7 合成麦的植株表现出良好的分蘖性和大田长势，其籽粒表现出良好的成穗和结实力，然而籽粒的颜色一致性较差，饱满度欠佳（图2）。

3 结论与讨论

本研究结果表明，从33个合成材料中，获得了9 个可以正常越冬的组合，证明利用硬粒小麦与粗山羊草创制人工合成六倍体冬性小麦是可行的。为了提高单倍体幼胚的成胚率、成苗率，本研究根据单倍体胚的状态，接种于不同的培养基上，并根据萌动和发育状态适时调整培养基。正常发育的胚接种于1/2 MS培养基Ⅱ上，发育不良的幼胚接种于添加2 mg/L 2，4-D的1/2 MS培养基Ⅲ中，待幼胚发育正常后转入培养基Ⅱ中，如在培养基Ⅲ内继续不良发育的幼胚转入添加了3 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培养基Ⅳ中，在培养基Ⅳ中的幼胚发育正常后转入1/2 MS 培养基Ⅱ中。为了提高幼苗的加倍率，采用体积分数为0.1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的1/2 根系8 h，14 d 后，同样的方法处理另外1/2根系。

目前，由粗山羊草和硬粒小麦合成的小麦存在以下问题：（1）不适宜我国冬麦区育种使用，我国使用的大都来自CIMMYT，而这些合成麦大都是春性的，不适合我国北方冬麦和黄淮海冬麦区使用[17-19]；（2）母本的选择受局限，进而存在遗传信息的局限性，目前在我国还有一部分合成麦来自带自然加倍基因的硬粒小麦Langdon 和粗山羊草合成[20]，母本只能选择Langdon，遗传信息非常狭窄[21-24]；（3）据统计目前合成方法的成胚率在10%左右，成苗率在4%左右[25]。本研究为解决现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题，提供了一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法[26]。

本研究选用的硬粒小麦作母本，由于母本不受限，扩大了母本遗传信息选择的范围，通过远缘杂交、幼胚培养和染色体加倍人工合成六倍体小麦，将硬粒小麦和粗山羊草中蕴藏的大量有用和被长期定向选择丢失的基因有效导入普通小麦，拓宽了小麦的遗传基础，与此同时，人工春化的过程使种子能顺利进入幼苗期进而适应北方冬麦区的温度环境，克服了温度对其生长的不利影响，此外，培养基Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的配合使用保障幼胚正常发育，进一步提高种子的成胚率、成苗率，有效解决了现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题。