欧李内生促生菌分离、鉴定及促生、耐盐碱特性

白 洁，姚 拓，王占军，雷 杨，杨晓蕾，张 蔚

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.宁夏农林科学院荒漠化治理研究所，宁夏 银川 750000)

欧李(Cerasushumilis)是一种落叶丛生小灌木，主要生长于我国北方的草原、森林、沙漠边缘以及一些丘陵地区[1]。其自身表现出的抗逆性是其在不良环境下稳定生长的重要原因之一，如耐寒、耐旱、耐盐碱等特性。因此，可作为防风固沙、抵抗水土流失、改善生态环境的先锋树种[2]。此外，由于欧李叶量大，茎细且质地柔软，便于牛羊的啃食，在畜牧业中被视为一种良好的饲料。前人研究发现，欧李茎叶中不仅含有糖和蛋白质等牛羊生长所需的一般营养，而且其钙元素含量较高，是牛羊骨骼发育的重要补钙来源[3]。因此，该灌木不管是在生态建设还是作为饲料生产方面均具有较大发展前景。

欧李所表现出的较强的生态价值，主要源于其庞大且呈网状分布的根系能够在瘠薄的土壤中吸收水分和营养物质，供给植物生长[4]。而定殖于植物根系内的内生促生菌(Plant growth-promoting endo phytes,PGPE)所分泌的多种生理活性物质，如生长素、细胞分裂素等，会刺激植物新陈代谢，促进植物根系生长[5]。此外，还可通过固氮、解磷(将有机磷水解转化为无机磷酸盐)[6]、溶磷(将不溶性无机磷转化为可溶性磷酸盐)[7]等方式促进植物生长[8-9]。谢安强等[10]从桉树体内分离筛选到的内生细菌，可提高桉树的抗逆性与生长量。张现勇等[11]从油菜中分离的菌株yc8，显著提高了油菜幼苗的鲜重和株高。然而，目前关于从生长良好的欧李根系中分离多功能PGPE的研究还未见报道。

鉴于此，本研究从欧李根系中分离获得PGPE菌株，并对其固氮、解磷、溶磷、合成植物生长素IAA和耐盐碱特性进行初步研究，利用分子生物学方法对其进行分类鉴定，以期为后续欧李微生物接种剂(菌肥)研制提供优良菌株，并丰富我国微生物菌种资源库。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源及处理 欧李样品来源于宁夏回族自治区银川市永宁县，位于宁夏中部，属于典型的温带大陆性气候，土壤质地为砂土。采集欧李植物根系，装入无菌自封袋中，标注植物名称及采集日期，放置于冰盒中，运回实验室冰箱中4℃保存，进行菌株分离。

1.1.2 供试培养基 LB(luria bertani,LB)固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0[12]。

King氏液体培养基：蛋白胨20 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，丙三醇15 mL，L-色氨酸0.1 g[13]。

无机磷(National botanical research institute’s phosphate,NBRIP)液体培养基：葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25g，MgCl2·6H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，总体积1 000 mL，pH 6.8～7.0[14]。

蒙金娜有机磷培养基：MnSO4·4H2O 0.03 g，Fe SO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，卵磷脂0.2 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，酵母膏0.4 g，总体积1 000 mL，pH 7.0～7.5[15]。

NFM (Nitrogen free medium,NFM)培养基：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，KOH 5 g，苹果酸5 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚蓝5 mL，琼脂20 g(固体培养基)或2 g(半固体培养基)，总体积1 000 mL，pH 7.0[16]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离与纯化 采用组织匀浆法[17]，将欧李根系置于自来水下冲洗干净，用8%次氯酸钠浸泡3 min，75%乙醇表面消毒30 s，使用无菌蒸馏水清洗3次，去除表面的灭菌剂。灭菌的植物根系用灭菌刀片切成约为1 g的小块，用高压灭菌的研磨棒和研磨钵在9 mL的无菌水中研磨至匀浆。将0.1 mL的组织悬浮液涂布于LB平板上。接种平板置于28℃恒温培养箱培养3～5 d。根据菌落形态与颜色的不同，使用接种环挑取单菌落进行四区划线，反复纯化至单一菌落。分离纯化后的菌株悬浮于20%甘油，保存至-80℃冰箱中备用。

1.2.2 内生促生菌促生特性测定 将分离出的7株菌分别进行促生特性测定，固氮酶活性测定：乙炔还原法[18]；解磷、溶磷特性测定：钼锑抗比色法[19]；合成植物生长素IAA特性测定：Salkowski法[20]。

1.2.3 内生促生菌耐盐碱特性测定 在LB液体培养基pH 7.0的条件下，将各培养基中的NaCl浓度分别提高5%，培养基中NaCl浓度分别为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%；在LB液体培养基中NaCl浓度为10 g·L-1的条件下，将培养基中pH值分别提高一个单位，各培养基中pH值分别为7、8、9、10、11、12、13。将分离菌株分别接种至具有不同盐碱浓度的LB液体培养基中，每株菌3次重复，以不接菌的液体培养基作为空白对照，在30℃，180 r·min-1条件下震荡培养2 d后，测定培养基在波长600 nm处的吸光度值(OD600 nm)并制作曲线。

1.2.4 分离菌株鉴定 将上述分离出的7株菌在LB平板上活化后，提取细菌总DNA，使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rRNA基因序列扩增。50 μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR扩增参数设置：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重复循环32次；72℃总延伸5 min，将PCR产物进行1%凝胶琼脂糖电泳检测，并于-20℃保存待用。16S rRNA基因序列测定由北京奥科鼎盛科技有限公司完成。将测序结果在Ezbiocloud数据库中比对，并利用MEGA 7.0软件中CLUSTAL W程序进行同源序列比对，使用邻近法构建系统发育树。

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，显著性水平为P<0.05，并用Origin Lab Origin Pro 8.5和MEGA 7.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 欧李内生促生菌分离菌株促生特性分析

由表1可看出，供试7株内生菌的固氮酶活性分布在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，以菌株Y3固氮酶活性最高，为127.40 nmol·h-1·mL-1。对分离菌株解磷、溶磷特性的测定中，菌株解有机磷量在1.28～358.90 μg·mL-1，菌株N23和N22均有较强的解磷能力，解磷量分别为358.90 μg·mL-1和342.20 μg·mL-1，其他5株菌解磷量均小于150 μg·mL-1；分离菌株溶无机磷量在6.29～143.61 μg·mL-1，菌株Y2和Y3相较于其他5株菌具有较强溶磷能力,溶磷量均大于100 μg·mL-1。通过对分离菌株解磷、溶磷能力的定量测定分析发现，不同菌株具有不同的解磷、溶磷特性，其中3株分离菌株出现解有机磷量大于溶无机磷量。此外，在合成植物生长素IAA特性测定中，菌株合成IAA量在14.24～70.48 μg·mL-1，以菌株N22合成IAA量最高。

表1 分离菌株促生特性测定结果Table 1 Determination result of the growth-promoting characteristics of isolated strains

2.2 欧李内生促生菌分离菌株耐盐碱特性分析

分离菌株对不同NaCl浓度的耐受性测定中，菌株Y1、Y2、N22、N23、N1能耐受NaCl最高浓度为10%。菌株Y4、Y3能耐受NaCl最高浓度为30%，说明该两株菌株具有较广泛的耐盐能力。此外菌株Y3、Y4、N1的最适NaCl浓度为5%(图1)。在10 g·L-1NaCl浓度下，菌株N1、N22碱性(pH值)的耐受范围为7～10，菌株N23碱性(pH值)的耐受范围为7～11，其中菌株N1、N22最适生长的碱性(pH值)耐受为8。此外，菌株Y1、Y2、Y3、Y4碱性(pH值)的耐受范围为7～13，其中菌株Y1、Y2、Y4最适生长的碱性(pH值)耐受为8，而菌株Y3的最适生长的碱性(pH值)耐受为9，该结果表明分离出的7株菌在10 g·L-1NaCl浓度下均具有一定的耐碱能力(图2)。

图1 分离菌株对不同NaCl浓度耐受性Fig.1 Tolerance of isolated strains to different NaCl concentrations

图2 分离菌株对不同碱性程度(pH值)的耐受性Fig.2 Tolerance of isolated strains to different alkaline (pH value)

2.3 欧李内生促生菌分离菌株鉴定

通过对7株分离菌株进行革兰氏染色，发现Y3、Y4、N1菌株为革兰氏阳性菌(G+)，其余菌株为革兰氏阴性菌(G-)。测序结果在Ezbiocloud数据库进行相似性比对(表2)，并使用MEGA 7.0软件构建系统发育树(图3)。结果显示，菌株Y4、Y3确定为芽胞杆菌属Bacillusp.，菌株N22、N23为猴假单胞菌Pseudomonassimiae，菌株Y1、Y2为无色杆菌Achromobactermarplatensis，N1为耐寒短杆菌Brevibacteriumfrigoritolerans。

图3 基于分离菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of the isolated strains

表2 分离菌株16S rRNA基因相似性比对Table 2 Comparison of 16S rRNA gene similarity of isolated strains

3 讨论与结论

PGPE是一类具有较强定殖和靶向功能的微生物，相较于土壤和根际微生物，接种后更易进入植物体内，并发挥相关功能[21]。本研究从欧李根系中分离获得7株内生细菌，包含4个属，分别为芽孢杆菌属、假单胞菌属、短杆菌属和无色杆菌属，其中假单胞菌属菌株表现出较强的解磷特性。前人研究发现，假单胞菌在植物根系中是一类较为活跃的解磷微生物[22-24]。本试验中，编号为N23菌株被初步鉴定为Pseudomonassimiae，其解有机磷量最高，为358.90 μg·mL-1，并且该菌株同时兼具固氮、合成植物生长素IAA、耐盐碱等特性，这在已报道的假单胞菌株中是较为少见的。另外，尽管有2株细菌同属于P.simiae，且这两株菌的16S rRNA基因序列与P.simiaeOLi的相似度均达到99.85%，但它们的促生潜力却具有显著差异,说明同一种属的内生细菌的促生潜力存在菌株间的差异，引起菌株间促生潜力的差异与细菌自身代谢能力、外界环境中碳源、氮源及微量元素的种类等诸多因素有关[25]，还需进一步研究。

欧李主要分布于我国北方地区，多山地丘陵或沙漠草原，土壤养分贫瘠，而固氮微生物在为植物提供氮源方面发挥很大作用。本研究测定分离菌株固氮酶活性在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，芽胞杆菌Y3固氮酶活性最高，为127.40 nmol·h-1·mL-1，与前人报道的芽胞杆菌固氮活性结果一致[26]。吲哚乙酸(IAA)是一种极为重要的生理活性物质，由包含PGPE在内的多种微生物产生[27-28]。本试验中分离的菌株均能够分泌植物生长素IAA，如果给宿主植物接种分泌IAA菌株，可扩大根表面积，利于根系从土壤中吸收水分和矿物质[29]，对提高欧李的产量和品质具有积极作用。

在PGPE菌株分离过程中，不仅要分离具有促生作用的菌株，还应筛选具有耐盐碱特性菌株，这对生产实践具有重要作用[30]。全球大约20%的耕地和50%的灌区受到盐碱化的影响[31]，内生菌能够从植物的多个方面来改善植物组织渗透平衡和离子毒害，从而缓解盐碱胁迫对植物的伤害，有利于植物在盐碱地生长[32]。根据Larsen等[33]和Vreeland[34]提出的微生物对盐碱敏感程度的分类系统，本试验分离菌株Y3、Y4能够在NaCl浓度为30%、pH值为13的条件下正常生长，属于极端嗜盐嗜碱微生物。推测该株菌与欧李能够生长在盐碱环境中有一定关系,可协助植物适应环境，并在盐碱地生物修复中具有很好的应用潜力。

本研究分离的7株内生菌均具有一定的促生功能(固氮、解磷、溶磷、合成植物生长素IAA)和耐盐碱特性，解有机磷量最高为342.20 μg·mL-1，溶无机磷量最高为143.61 μg·mL-1，固氮酶活性最高为125.9 nmol·h-1·mL-1；合成植物生长素IAA量最高为70.48 μg·mL-1，耐盐碱特性较强的菌株可在NaCl浓度为30%，pH值为13的条件下正常生长。7株优良PGPE被鉴定为：Y3、Y4为Bacillussp.，N23、N22为Pseudomonassimiae，N1为Brevibacteriumfrigoritolerans，Y1、Y2为Achromobactermarplatensis。各菌株之间促生潜力存在显著差异，可为后续复合微生物菌剂(菌肥)研发提供依据。