异氟醚全身麻醉对腰椎间盘突出症大鼠海马区小胶质细胞活化及炎症的影响▲

张 玲 陈 尧 程 超 赵志刚

(湖北省黄石市中医医院1 麻醉科，2 骨科，黄石市 435000，电子邮箱:dzyx_13@163.com；3 湖北省武汉市普爱医院微创脊柱外科，武汉市 430032)

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)是骨科常见疾病，我国每年新患病人数约为150万例，近年来随着我国老龄化加剧其发病率逐年升高[1]。对于保守治疗无效的LDH，手术效果确切，是重要的治疗手段，但手术具有创伤性，且麻醉可影响患者认知功能，导致术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)发生率高[2]。研究显示，在非心脏大手术后的出院患者中，老年患者POCD发生率达40%，40岁以下患者POCD发生率也达36%，POCD对患者生活质量造成严重影响[3]。研究表明，手术等创伤性操作可导致机体产生免疫应激，免疫应激可引起炎症反应尤其是中枢神经系统(central nervous system，CNS)的炎症反应，继而可引发POCD[4]。另有研究证实，异氟醚麻醉是诱发CNS炎症反应的重要因素[5]，但具体机制仍不明确。因此，明确异氟醚麻醉诱发CNS炎症反应的作用机制，对临床上预防POCD的发生有重要意义。小胶质细胞是CNS中重要的免疫细胞，其活化水平与炎症反应进展关系密切。本研究采用异氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，诱导CNS炎症反应，观察建模后大鼠海马组织中小胶质细胞活化及炎症反应情况，探究CNS炎症反应发病机制，为POCD的预防提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠40只，3月龄，体质量230～270 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。大鼠自由饮水进食，饲养于12 h明暗交替、湿度为50%～60%、室温为22℃～25℃的环境，动物实验符合减少、替代和优化的原则。

1.2 主要试剂和仪器 异氟醚(山东鲁南贝特制药有限公司，批号：20201305)，兔抗大鼠离子钙结合衔接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1；美国Abcam公司，批号：ab10354)，链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：SA0011)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、防淬灭封片剂(上海碧云天生物技术研究所，批号：C1002、P0131-5)，兔抗大鼠含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptotic-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)多抗(美国ZenBio公司，批号：30895、35602，BK-K5533)，山羊抗兔荧光二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：AMJ-AB2011)，白细胞介素 1β(interleukin，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国R&D公司，批号：HS2098、MTA00B)，二喹啉甲酸蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo公司，批号：23227)。旷场实验、条件恐惧实验器材(上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XC404)，激光共聚焦显微镜、切片机(德国徕卡显微系统贸易公司，型号：SP8、SM2010R)，化学发光成像分析系统(美国Bio-Rad公司，型号：CheniDoc XRS)。

1.3 分组及建模方法 采用体质量排序随机分组法将40只大鼠分为对照组10只、模型组30只。参照文献[6]，采用自体髓核移植法，取模型组大鼠建立LDH模型，将大鼠置于连接小动物麻醉机的透明盒中，调节异氟醚吸入浓度为2.0%，诱导麻醉后取出，将大鼠固定于手术台上，以2.0%异氟醚通过呼吸面罩维持麻醉。无菌条件下距尾根约4 cm处断尾，切开尾部椎间盘，取椎间盘髓核组织约4 g，置于无菌生理盐水中备用，缝合伤口。背部剃毛消毒，沿背正中做4 cm切口，钝性分离皮肤、筋膜及肌肉，行L5、L6左侧椎板和部分上下关节突切除术，暴露马尾神经及左侧L5神经根；将自体髓核组织放置于L5背根神经节硬膜囊交界处，采用4-0肠线环扎L5、L6神经根，以肠线接触神经根但无明显压迫为宜，局部固定牢固，逐层缝合伤口。建模后1～3 d每只大鼠腹腔注射青霉素预防感染。对照组不进行麻醉和手术操作。

1.4 观察指标

1.4.1 行为学观察：建模后第1天，采用旷场实验及条件恐惧实验观察大鼠行为学。(1)旷场实验。将大鼠放入旷场(长×宽×高为100 cm×100 cm×50 cm)底面中心，摄像系统记录大鼠5 min内在旷场中心区域活动时间。每只大鼠实验结束后清理粪便并用75%酒精擦拭旷场底部和内壁。(2)条件恐惧实验。将大鼠置于测试箱中适应3 min，然后给予3.0 kHz、65 dB声音刺激，时间为30 s，最后2 s同时给予0.7 mA足底电击，声音及电刺激结束后，继续在测试箱中停留2 min后，放回饲养笼。24 h后，再次将大鼠放置测试箱内，不给予刺激，记录3 min内环境诱发僵直行为。2 h后改变测试箱箱底颜色，再次放入大鼠，给予相同参数声音刺激3 min，记录3 min内环境或声音诱发僵直时间占比，僵直时间占比=僵直时间/3 min×100%。

1.4.2 病理组织标本采集：行为学测试结束后，于建模后2、4、8 d，按照随机数字表法各选取10只模型组大鼠分批处死，并于实验开始后2 d将对照组10只大鼠全部处死。按照随机数字表法，对照组取5只、模型组每批次取5只大鼠，剖开胸腔，剪开右心耳，从左心室快速灌注预热生理盐水，至流出灌注液无血色，再缓慢灌注200 mL 4%多聚甲醛固定。断头，分离小脑，取双侧海马组织，将左右侧海马组织分瓶保存于4%多聚甲醛中固定备用。对照组和模型组其余大鼠仅心脏灌注生理盐水后，快速断头后取双侧海马组织，左右侧分开保存于-80℃备用。

1.4.3 小胶质细胞数量检测：取保存于4%多聚甲醛的左侧海马组织，制备厚度为10 μm的冰冻切片，切片经3% H2O2孵育20 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤，0.3% Triton X-100于37℃孵育25 min，牛血清白蛋白封闭30 min，加入一抗兔抗大鼠Iba-1(1 ∶800)，4℃孵育过夜，PBS洗涤，加入SABC试剂盒中生物素标记的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，室温孵育2 h；PBS洗涤后加入SABC孵育1 h，PBS洗涤后进行二氨基联苯胺显色，中性树胶封片，显微镜下观察并计数海马CA1区Iba-1标记的小胶质细胞数。每张切片取高倍镜(×400倍)下5个随机视野计数，5个视野计数之和为每张切片内小胶质细胞总数。

1.4.4 小胶质细胞内NLRP3活化情况检测：取保存于4%多聚甲醛中的右侧海马组织，制备厚度为8 μm的冰冻切片，PBS洗涤后加入10%山羊血清室温封闭1.5 h，弃去血清勿洗涤，加入兔抗大鼠NLRP3稀释抗体(1 ∶50)，4℃孵育过夜，PBS洗涤，加入罗丹明与山羊抗兔荧光二抗(1 ∶100)混合液，避光室温孵育2.5 h，PBS洗涤，加入DAPI核染6 min；PBS洗涤加入抗荧光淬灭剂，暗室中于激光共聚焦显微镜下观察小胶质细胞内NLRP3活化情况，其中红色荧光为细胞质内活化的NLRP3，蓝色荧光为细胞核。

1.4.5 海马组织IL-1β、TNF-α水平检测：取保存于-80℃的左侧海马组织，组织剪剪碎后，匀浆，3 000 r/min离心12 min取上清液，采用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α水平，按照试剂盒说明书要求操作，于全波长酶标仪(美国Thermo Fisher，型号：Multiskan SkyHigh)上测定波长570 nm处吸光度值，根据标准曲线计算待测样本浓度。

1.4.6 海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达量检测：取保存于-80℃的右侧海马组织，加入液氮研磨后加入细胞裂解液于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min 离心15 min取上清液，进行二喹啉甲酸蛋白定量；取50 μg蛋白样本与等体积上样缓冲液混匀，沸水浴10 min变性，室温1 2000 r/min离心15 min取上清液，蛋白上样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后进行电转印，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h 后，加入稀释的一抗(1 ∶500)于4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入稀释的二抗(1 ∶2 000)于室温孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，暗室中曝光、显影。于凝胶成像系统扫描拍照，采用灰度值分析软件分析蛋白条带的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参(美国Abcam公司，型号：Ab9485)。以目的蛋白灰度值/内参灰度值表示目的蛋白相对表达情况。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料均以(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 造模后，模型组大鼠跛行，术侧后爪屈曲、握紧或下垂，休息时出现反复舔舐术侧后爪，或轻咬趾甲现象，但均未造成趾甲脱落；除运动功能缺陷外，大鼠还出现烦躁、食量减少、毛发无光泽等现象，随着建模时间的延长，以上症状加重。对照组无上述症状，一般情况均正常。提示本研究中模型组大鼠均造模成功。

2.2 两组大鼠行为学指标的比较 模型组环境诱发僵直时间占比较对照组降低(P<0.05)；两组中心区域活动时间、声音诱发僵直时间占比差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 两组大鼠行为学指标的比较(x±s)

2.3 两组大鼠海马组织CA1区Iba-1标记的小胶质细胞数量 免疫组化染色结果显示，对照组、模型组建模后2、4、8 d海马组织CA1区Iba-1标记的小胶质细胞数量分别为(658.40±15.58)个/视野、(1 033.20±25.06)个/视野、(859.60±22.13)个/视野、(725.40±18.97)个/视野，组间比较差异有统计学意义(F=636.513，P<0.001)。与对照组比较，模型组建模后2、4、8 d小胶质细胞数量均增多(均P<0.05)，但模型组建模后2、4、8 d小胶质细胞数量依次减少 (均P<0.05)。见图1。

图1 各组海马组织CA1区Iba-1标记的小胶质细胞(免疫组化染色，×40)

2.4 两组大鼠小胶质细胞内NLRP3活化情况 激光共聚焦显微镜观察显示，对照组海马组织细胞质活化NLRP3较少，模型组建模后2 d海马组织细胞质内NLRP3大量激活，随着建模时间的延长，细胞质内活化NLRP3逐渐减少，建模后8 d最少。见图2。

图2 免疫荧光染色观察海马组织小胶质细胞内NLRP3(激光共聚焦显微镜，×400)

2.5 两组海马组织IL-1β、TNF-α水平的比较 与对照组比较，模型组建模后2 d海马组织IL-1β、TNF-α水平及建模后4 d TNF-α水平升高(均P<0.05)；与模型组建模后2 d比较，建模后4 d、8 d海马组织IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)，但建模后4 d与8 d比较，海马组织IL-1β、TNF-α水平无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 两组海马组织IL-1β、TNF-α水平的比较(x±s)

2.6 两组大鼠海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达情况的比较 与对照组比较，模型组建模后2、4、8 d海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相对表达量均升高(均P<0.05)；随建模时间的延长，模型组海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相对表达量逐渐降低(均P<0.05)。见图3和表3。

图3 两组大鼠海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达情况

表3 两组大鼠海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达相对表达量的比较(x±s)

3 讨 论

随着医疗技术的进步，全球手术量剧增，但术后并发症也急剧增多，其中POCD是多种手术术后常见的并发症，而腹部手术、骨科手术术后POCD发病率明显高于其他类型的手术[7]。研究显示，患者年龄、基础疾病、受教育水平及麻醉用药与POCD的发病密切相关[8]。但POCD发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明，而CNS炎症反应学说已得到研究学者广泛认可。海马是CNS中与学习、认知关系密切的重要脑区[9]，了解海马区炎症反应对探讨CNS功能障碍的发生机制有重要意义。异氟醚是临床常用的麻醉药物，但有研究显示异氟醚麻醉是诱发CNS炎症反应的重要因素[5]。本研究采用异氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，观察建模后小胶质细胞活化及炎症反应的情况，探讨CNS炎症反应的发生机制。

Zhu等[10]应用异氟醚吸入麻醉建立POCD小鼠模型，结果显示外周免疫细胞可透过血脑屏障引起海马区炎症反应，加重异氟醚所致的POCD。Wang等[11]采用1.5%异氟醚麻醉小鼠，1周后对其进行水迷宫实验，发现小鼠出现POCD，且海马组织IL-1β、IL-18炎症因子水平升高。上述研究均提示异氟醚麻醉可导致CNS功能障碍及海马组织炎症反应。本研究的旷场实验结果显示，两组大鼠中心区域活动时间差异无统计学意义(P>0.05)，说明异氟醚麻醉对LDH大鼠的机体运动功能无明显伤害；条件恐惧实验结果显示，模型组环境诱发僵直时间占比低于对照组(P<0.05)，但两组声音诱发僵直时间占比差异无统计学意义(P>0.05)，说明异氟醚麻醉可造成LDH大鼠海马依赖性记忆(环境诱发僵直)受损，而对非海马依赖性记忆(声音诱发僵直)无明显影响。而本研究模型组建模后2 d海马组织IL-1β、TNF-α水平升高，与既往研究结果[12]相符；建模后4 d、8 d海马组织IL-1β、TNF-α水平低于建模后2 d，说明异氟醚对LDH大鼠造成的海马组织炎症有自行减轻的趋势。

小胶质细胞是固有免疫系统的重要防线，正常生理情况下处于静息状态，当CNS处于应激状态时小胶质细胞迅速活化，并持续释放炎症介质(如IL-1β、TNF-α)，参与氧化应激反应，导致CNS功能受损，造成脑认知功能受损[13]。Karpenko等[14]发现，帕金森病患者脑脊液中IL-1β、TNF-α水平显著升高，且与病程、认知功能受损程度关系密切。NLRP3主要存在于小胶质细胞胞质，由病原菌、应激等刺激信号激活，通过募集接头蛋白ASC，激活下游Caspase1，进而将前体IL-1β加工为成熟IL-1β，参与调控炎症反应[15-16]。Li等[17]敲除雄性C57BL/6小鼠的NLRP3基因后，发现小鼠对空气污染颗粒诱导的神经毒性及炎症反应减轻，海马依赖性学习记忆损害得以改善。上述研究均说明小胶质细胞内NLRP3活化在CNS炎症反应中发挥重要作用。本研究结果显示，模型组建模后2、4、8 d小胶质细胞数量增多，NLRP3活化水平升高，且海马组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相对表达量均升高，但随建模时间的延长小胶质细胞数量、NLRP3活化水平及NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达均逐渐降低(P<0.05)。提示异氟醚全麻可能通过促进LDH大鼠海马区小胶质细胞质中NLRP3活化以上调IL-1β、TNF-α表达，从而引发LDH大鼠的CNS炎症反应，进一步提示抑制小胶质细胞NLRP3活化对防治POCD具有潜在价值。

综上所述，应用异氟醚进行全身麻醉可能通过促进LDH大鼠海马区小胶质细胞质中NLRP3的活化从而诱导IL-1β、TNF-α表达上调，导致CNS炎症反应的发生。