血清微小RNA-150表达水平与晚期非小细胞肺癌患者行表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗效果及预后的关系▲

关 英 郭丽云 王千千 阿选德

(1 青海省西宁市第一人民医院呼吸内科，西宁市 810000，电子邮箱：gy55255@163.com；甘肃省肿瘤医院2 放疗科，3 肿瘤内科，兰州市 730000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有类型肺癌的85%以上，其起病隐匿，早期无明显症状，故患者确诊时多为临床晚期，错失手术治疗时机[1]。近年来，分子靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)被广泛应用于晚期NSCLC患者的治疗中，其可有效地改善患者生活质量，延长患者生存时间[2]。目前，临床上多通过复查MRI或CT评估NSCLC患者的治疗效果，同时一些常见的血清肿瘤标志物也可作为评估NSCLC患者疗效的辅助指标[3-4]。研究显示，微小RNA(microRNA，miRNA)-150在NSCLC患者血清中呈高表达，其可能通过靶向结合SRC激酶信号抑制剂1基因从而促进NSCLC细胞的增殖及迁移，被认为是诊治NSCLC的潜在靶标[5]。但血清miRNA-150水平与晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治疗的效果、预后之间关系的相关研究鲜少。基于此，本研究探讨血清miRNA-150水平与NSCLC患者行EGFR-TKI治疗效果及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月至2017年12月西宁市第一人民医院收治的172例晚期NSCLC患者为研究对象。其中男性82例、女性90例，患者年龄46～85(66.54±10.39)岁；有吸烟史者102例，无吸烟史者70例；腺癌134例，非腺癌38例。纳入标准：(1)均符合NSCLC诊断标准[6]，均经细胞学、组织学病理学明确诊断；(2)均为原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移分期Ⅲ～Ⅳ期；(3)均对本研究所用药物无禁忌证；(4)临床检查资料完整；(5)患者及其家属均对本研究知情同意，自愿参与本研究。排除标准：(1)合并严重心血管系统疾病者；(2)合并其他恶性肿瘤、严重肝肾功能障碍者；(3)失访者；(4)病理诊断不明确者。本研究符合伦理学有关规定，获得西宁市第一人民医院医学伦理委员会审核、批准后实施。

1.2 主要试剂与仪器 TRIzol Reagent(批号：J44580)购买于上海金穗生物科技有限公司，TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit(批号：4366597)购买于上海北诺生物科技有限公司，TaqMan® MicroRNA Assay(批号：MTTXXXXX-ZTD)购买于北京百奥莱博科技有限公司。超微量分光光度计(型号：OSE-260)购买于天根生化科技(北京)有限公司，实时荧光定量PCR仪(型号：4351104)购买于北京智杰方远科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 治疗及随访方法：NSCLC患者均口服EGFR-TKI吉非替尼(英国阿斯利康公司，国药准字J20100014)1片/d(2周为1个疗程)，直到难以耐受或肿瘤进展[7]，同时给予常规局部放疗。具体放疗方案：选取6MV-X线，4野照射进行放疗，5次/周照射，2～3 Gy/次，共四周。患者每月进行头部、胸部CT、MRI-腹部B超和全身骨SPECT/CT扫描检查，评估转移灶范围及大小。对172例NSCLC患者进行长期随访，随访时间从接受EGFR-TKI治疗开始，截至2019年12月30日，或至患者死亡。

1.3.2 疗效评价：2个疗程结束后评价NSCLC患者服用吉非替尼的疗效，以头部、胸部CT、MRI、胸腹部B超扫描和全身骨SPECT/CT扫描为依据，按照RECIST 1.1版实体瘤疗效评价标准[7]进行疗效判定。其中，完全缓解指治疗后所有肿瘤病灶均消失，并维持1个月以上；部分缓解指治疗后肿瘤病灶最大直径总和较前缩小>30%，并维持1个月以上；疾病稳定指治疗后肿瘤病灶直径略有缩小，但未达部分缓解水准，或肿瘤病灶最大直径有所增加，但未超过20%；疾病进展指治疗后肿瘤病灶最大直径总和较前增加超过20%，或出现新病灶。治疗总有效率=(完全缓解例数+部分缓解例数)/总例数×100%。根据治疗效果将NSCLC患者分为有效组、无效组，将完全缓解、部分缓解患者纳入有效组，将疾病稳定、疾病进展患者纳入无效组。

1.3.3 血清样本采集：在治疗前和接受2个疗程后，收集所有患者清晨空腹肘静脉血3～4 mL，静置25～30 min，3 800 r/min离心8 min，获得血清，分装密封保存于-80℃冰箱中备用待检。

1.3.4 实时荧光定量PCR法检测血清miRNA-150相对表达水平：解冻冻存血清样本，利用TRIzol Reagent试剂提取样本总RNA。参照TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit说明书将DNA反转录为cDNA。以适量cDNA为模板，参考TaqMan® MicroRNA Assay说明书配制反应体系，进行PCR扩增反应。反应体系包括cDNA 2 μL，2×Taqman® Universal Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无核酸酶水6 μL，总体积为20 μL。以U6为内参基因。miRNA-150上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6上游引物序列为5′- CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列为5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。每个样本设置3个复孔，以2-ΔΔCt法计算miRNA-150相对表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier曲线法绘制生存曲线，并采用log-rank检验分析生存曲线间的差异；采用Cox回归模型分析NSCLC患者预后的影响因素。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EGFR-TKI治疗效果及不同疗效NSCLC患者血清miRNA-150相对表达水平的比较 经EGFR-TKI治疗后，172例NSCLC患者血清中治疗有效46例，治疗无效126例，有效率为26.74%(46/172)。治疗前，172例NSCLC患者血清miRNA-150相对表达水平为(1.76±0.67)，有效组、无效组患者血清miRNA-150相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，有效组血清miRNA-150相对表达水平低于治疗前和无效组(均P<0.05)，无效组血清miRNA-150相对表达水平高于治疗前(P<0.05)。见表1。

表1 不同疗效NSCLC患者血清miRNA-150相对表达水平的比较(x±s)

2.2 不同临床特征NSCLC患者的EGFR-TKI疗效比较 与有吸烟史者相比，无吸烟史的NSCLC患者的EGFR-TKI治疗有效率更高(P<0.05)；治疗前血清miRNA-150相对表达水平<1.76的NSCLC患者治疗有效率更高(P<0.05)；NSCLC患者的年龄、性别、组织学类型与EGFR-TKI治疗效果无关(均P>0.05)。见表2。

表2 不同临床特征NSCLC患者的EGFR-TKI疗效比较[n(%)]

2.3 治疗前血清miRNA-150相对表达水平与NSCLC患者预后的关系 对172例NSCLC患者进行随访0～24个月，死亡117例，存活率为31.98%(55/172)。Kaplan-Meier生存分析显示，治疗前血清miRNA-150相对表达水平<1.76者的平均生存期为21.02个月，miRNA-150相对表达水平≥1.76者的平均生存期为16.75个月，miRNA-150相对表达水平<1.76者的累积生存率高于miRNA-150相对表达水平≥1.76者(χ2=34.707，P<0.001)见图1。

2.4 NSCLC患者行EGFR-TKI治疗后生存情况的影响因素 以NSCLC患者年龄(<65岁=0，≥65岁=1)、性别(女=0，男=1)、吸烟史(无=0，有=1)、组织学类型(腺癌=0，非腺癌=1)、治疗前血清miRNA-150相对表达水平(<1.76=0，≥1.76=1)为自变量，以NSCLC患者预后为因变量(生存=0，死亡=1)，进行多因素Cox回归分析，结果显示，组织学类型、血清miRNA-150相对表达水平是NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情况的独立影响因素(均P<0.05)。见表3。

图1 治疗前血清miRNA-150相对表达水平与NSCLC患者预后的关系

表3 NSCLC患者行EGFR-TKI治疗后生存情况影响因素的Cox回归分析

3 讨 论

NSCLC是最常见的肺癌类型，其发病率及病死率极高，预后较差，严重影响患者生存质量[8]。化疗是治疗晚期NSCLC患者的主要手段，但化疗效果欠佳及药物的毒副作用限制其临床应用范围。研究显示，EGFR-TKI靶向治疗已成为治疗表皮生长因子受体基因敏感突变的晚期NSCLC患者的首选方案[9]。本研究结果显示，EGFR-TKI治疗NSCLC患者的有效率为26.74%，与高原等[10]的研究结果相似，提示EGFR-TKI治疗晚期NSCLC具有一定临床疗效。

临床上多采用影像学手段评价NSCLC患者的治疗效果，但影像学检查费用昂贵，具有辐射副作用，不适合短时间重复检查，存在一定局限性。而血清标志物对恶性肿瘤的治疗效果有一定评估价值，且血清学指标具有取样方便、检测快速、重复性好等特点。miRNA广泛分布于外周血及各器官组织中，其可调控细胞增殖、凋亡、免疫调节、信号传导、炎症反应等生物学过程，在直肠癌、肝癌、胰腺癌、NSCLC等多种肿瘤的发生和发展过程中发挥重要调节作用[11-13]。研究显示，miRNA-150-5p是miRNA-150家族成员之一，其在NSCLC中表达失调，可通过靶向调节高迁移率族蛋白A2等的表达水平，影响NSCLC细胞的转移及复发[14]。另有研究显示，miRNA-150在NSCLC中表达上调，其可通过靶向负调控叉头样转录因子O4，进而影响上皮-间充质转化，促进NSCLC细胞转移，此外，而敲除叉头样转录因子O4表现出和miRNA-150过表达类似的分子效应，由此可见miRNA-150可能通过调控相关信号通路，在上皮-间充质转化过程中起到促进作用[15]。徐建林等[16]发现，miRNA-150在NSCLC患者肿瘤组织中过表达，miRNA-150高水平者预后较差，认为其有望成为诊断NSCLC及预后监测的分子标志物。以上研究表明，异常表达的miRNA-150与NSCLC的发生和发展进程关系密切。本研究结果显示，EGFR-TKI治疗后，有效组血清miRNA-150相对表达水平低于治疗前和无效组(P<0.05)，无效组血清miRNA-150相对表达水平高于治疗前(P<0.05)，提示miRNA-150可能在NSCLC的发展过程中发挥重要作用，且治疗前血清miRNA-150水平与晚期NSCLC患者EGFR-TKI治疗效果有关。推测可能原因为miRNA-150作为miRNA家族一员，其可能通过与靶基因结合影响信号传导，进而影响NSCLC细胞的增殖、凋亡、转移及侵袭等生物学过程，从而影响NSCLC的发展进程；如吉非替尼等EGFR-TKI可通过与三磷酸腺苷竞争酪氨酸激酶位点，进而抑制胞内酪氨酸激酶的磷酸化，抑制表皮生长因子受体信号传导，抑制癌细胞增殖、生长及血管生成等，从而在进展性及复发性NSCLC中发挥抗肿瘤作用[17]。由此，miRNA-150可能是吉非替尼等EGFR-TKI的作用靶点，NSCLC患者经EGFR-TKI治疗后，miRNA-150水平发生变化，提示miRNA-150水平变化能反映EGFR-TKI的治疗效果。此外，经EGFR-TKI治疗后，有效组NSCLC患者病灶显著缩小，恶性肿瘤生长及转移受抑制，血清miRNA-150相对表达水平可能受影响。

本研究结果显示，无吸烟史、治疗前血清miRNA-150相对表达水平<1.76的患者行吉非替尼治疗的效果更好。治疗前血清miRNA-150相对表达水平<1.76的NSCLC患者经吉非替尼治疗后的生存率高于治疗前血清miRNA-150相对表达量≥1.76的患者(P<0.05)；进一步行多因素Cox回归分析，发现组织学类型、治疗前血清miRNA-150相对表达水平是影响NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情况的独立影响因素(P<0.05)。这提示治疗前血清miRNA-150表达水平异常均可能会影响NSCLC患者行EGFR-TKI治疗后的预后情况，动态监测血清miRNA-150水平，有利于评估患者预后状况。

综上所述，治疗前血清miRNA-150表达水平低与晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治疗的效果及预后较好密切相关，监测血清miRNA-150水平或有助于评估NSCLC患者预后。但本研究样本量较少，实验结果可能出现偏差，后续将增加样本量进行深入探究。