雷公藤多苷对湿疹大鼠皮损的预防作用及机制

张明昊，董文霞，薛鹏坤，高一盈，马伟洋，王珍，马峰伟，张圣欣，李丰

1河南中医药大学医学院，郑州450046；2河南中医药大学药学院

湿疹是发生于表皮及真皮浅层的过敏性皮肤疾病，可由遗传因素导致，也可由外部环境和生活方式引起，发病时可见皮疹对称分布，瘙痒且有渗出倾向，易反复发作。目前临床上治疗湿疹的药物以糖皮质激素制剂和抗组胺药为主，用药时间长，虽可缓解症状但难以有效治愈，且会存在机体抗感染能力降低、胃酸及胃蛋白酶分泌增多等不良反应，停药后症状易复发[1]。中药因其疗效好、不良反应小的优势，逐渐成为开发新型湿疹治疗药物的主要来源。雷公藤多苷是从中药雷公藤根部提取的有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、调节机体免疫功能等多种药理作用[2-3]。考虑到止痒和抗炎是治疗湿疹的两个基本思路，我们将雷公藤多苷用于湿疹大鼠，观察其对湿疹皮肤的预防效果。由于中药具有多功效、多靶点的特点，组胺受体H1(H1R)/瞬时感受器电位受体1(TRPV1)通路、蛋白酶激活受体2(PAR-2)/TRPV1通路是皮肤湿疹痒觉发生的主要依赖途径；丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)通路又与皮炎、湿疹等多种炎症疾病的发生过程密切相关；故本研究基于H1R、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信号通路探讨雷公藤多苷对大鼠湿疹的预防作用，旨在为雷公藤多苷治疗湿疹提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量180～200 g，鼠龄8周，购于郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，动物生产许可证号：SCXK(豫)2019-0002。饲养于河南中医药大学医学机能实验室，饲养环境温度为20～22 ℃，相对湿度为55%～60%，正常光照，大鼠自由饮水采食。本实验经河南中医药大学动物伦理委员会审核批准。

1.1.2 药品与试剂 雷公藤多苷片(远大医药黄石飞云制药有限公司)。2,4-二硝基氯苯(DNCB，上海麦克林生化科技有限公司)，使用前加入丙酮橄榄油配制成DNCB-丙酮橄榄油溶液。丙酮、二甲苯、甲醛、无水乙醇(烟台市双双化工有限公司)，苏木素染色液、伊红染色液(上海尚宝生物科技有限公司)，H1R抗体、PAR-2抗体、TRPV1抗体、p38 MAPK抗体、p-p38 MAPK抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，β-actin抗体、RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、显影定影试剂、ECL试剂盒、HRP标记山羊抗兔二抗(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器与设备 BS110S型电子天平(德国公司Sartorius公司)；MR-96TB型酶标仪[骋克仪器(上海)有限公司]；D3024R型台式高速冷冻型微量离心机[大龙兴创实验仪器(北京)有限公司]；CX23光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；BV-2型垂直电泳仪、BT-2型转印电泳仪、MX-F型涡旋混合器(武汉赛维尔生物科技有限公司)；6300型化学发光仪(上海勤翔科学仪器有限公司)。

1.2 动物分组与造模 将50只大鼠随机分为5组，分别为正常组、模型组和雷公藤多苷低、中、高剂量组，每组各10只。模型组和雷公藤多苷低、中、高剂量组采用DNCB诱导建立湿疹模型。对大鼠腹部及背部脱毛，裸露皮肤面积约为2 cm×2 cm。用微量移液器吸取80% DNCB-丙酮橄榄油溶液100 μL涂抹于腹部脱毛区致敏，1次/天，连续2 d。第6天用0.5% DNCB-丙酮橄榄油溶液100 μL涂抹于大鼠背部脱毛区进行激发；同时在大鼠右耳内外侧耳面均匀涂抹1% DNCB-丙酮橄榄油溶液5 μL进行激发，1次/3天，共激发5次。

1.3 药物干预 从实验第3天开始，雷公藤多苷低、中、高剂量组分别给予4.5、9、18 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续灌胃21 d。

1.4 大鼠背部皮肤外观情况观察 末次给药24 h后，观察各组大鼠背部造模区皮肤是否出现红肿、丘疹、水疱、糜烂、渗出等湿疹表现。

1.5 大鼠耳肿胀度和耳肿胀抑制率测算 大鼠脱颈椎处死，沿耳基线剪下双耳，用8 mm打孔器在左右耳中部同一位置打孔取圆形耳片；用电子天平精确称重后按下列公式计算耳肿胀度和耳肿胀抑制率。耳肿胀度=右耳片质量-左耳片质量。耳肿胀抑制率(%)=(模型组耳肿胀度-药物干预组耳肿胀度)/模型组耳肿胀度×100%。

1.6 大鼠背部皮肤组织形态学观察 采用HE染色法。取背部造模区皮肤组织，生理盐水冲洗后，加入4%多聚甲醛固定。经脱水、透明、包埋，切4 μm厚切片，进行HE染色，常规切片脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态学变化。

1.7 大鼠背部皮肤组织H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表达检测 采用免疫组织化学法。石蜡切片，脱蜡、水化，H2O2封闭，PBS清洗，柠檬酸盐缓冲液热修复，滴加山羊血清封闭液室温孵育。分别滴加H1R、PAR-2、TRPV1抗体(稀释比例1∶100)，4 ℃孵育过夜；滴加二抗(稀释比例1∶100)37 ℃孵育20 min。DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染3 min，盐酸乙醇分化，自来水再次冲洗，经切片脱水、透明、封片后镜检。每组选取5张切片，采用Image-Pro Plus6.0测定每个视野中平均光密度值，作为目标蛋白的表达量。

1.8 大鼠背部皮肤组织p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达检测 采用Western blotting法。取背部造模区皮肤组织，用液氮速冻，-80 ℃储存备用。取皮肤组织匀浆，提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，一抗、二抗孵育，TBST漂洗，ECL试剂盒显影成像，采用Image J软件测定条带灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比值计算p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组背部皮肤外观表现 正常组生存状态良好，皮肤光滑完整，无明显异常；模型组背部造模区皮肤出现红肿、丘疹、水疱、糜烂和渗出等湿疹表现；雷公藤多苷低、中、高剂量组背部造模区皮肤红肿、糜烂及渗出程度降低，丘疹和水疱出现不同程度消散，皮肤较模型组明显光滑。

2.2 各组耳肿胀度、耳肿胀抑制率比较 与正常组比较，模型组耳肿胀度增加(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组耳肿胀度减少(P均<0.05)；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组耳肿胀度减少，耳肿胀抑制率增加(P均<0.05)。见表1。

表1 各组耳肿胀度和耳肿胀率比较

2.3 各组背部皮肤组织形态学比较 与正常组比较，模型组背部皮肤表皮厚度较正常组增加，角化程度升高，呈网状并伴有海绵样水肿，毛囊口可见角栓；真皮层中可见血管轻度扩张、充血，并伴有淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润。雷公藤多苷低、中、高剂量组背部皮肤表皮轻微增厚，可见轻微海绵样水肿和少量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润。

2.4 各组背部皮肤组织H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比较 正常组皮肤组织中有少量H1R、PAR-2、TRPV1表达；模型组H1R、PAR-2、TRPV1表达较对照组增加(P均<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组H1R、PAR-2、TRPV1表达降低(P均<0.05)；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷高剂量组H1R、PAR-2蛋白水平升高，雷公藤多苷中剂量组TRPV1蛋白水平升高，雷公藤多苷中、高剂量组p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组背部皮肤组织中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比较

2.5 各组背部皮肤组织p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达比较 与正常组比较，模型组皮肤组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平升高(P均<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷低、中、高剂量组p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平降低(P均<0.05)；与雷公藤多苷低剂量组比较，雷公藤多苷中、高剂量组p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平降低(P均<0.05)。见表3。

表3 各组背部皮肤组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达比较

3 讨论

湿疹是皮肤科常见性、多发性及难治性疾病之一，临床以剧烈瘙痒、多样性皮疹为主要表现，严重影响患者的身体健康和生活质量[4]。湿疹发病机制较为复杂，目前认为该病是由多种因子引发的表皮及真皮浅层炎症性疾病，属迟发性变态反应[5]。本研究采用DNCB高浓度腹部致敏，低浓度背部、耳部激发的方式构建大鼠湿疹模型，结果显示湿疹大鼠耳肿胀度升高，背部造模区表皮增厚且过度角化，真皮层见炎症细胞浸润，表明造模成功。该模型背部及耳廓局部病理特征与人类湿疹相似，可用于药物疗效的评价。雷公藤为卫矛科雷公藤属的木质藤本植物，始载于《神农本草经》，名莽草，主治头风、痈肿、乳肿和疝瘕。雷公藤多苷是从雷公藤植物根中提取的总苷，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用[6-7]，可用于自身免疫及皮炎湿疹疾病的治疗，且未见明显不良反应[8]。本研究结果显示，雷公藤多苷能够降低湿疹大鼠耳肿胀度，减轻背部造模区皮肤组织中海绵样水肿及炎性细胞浸润程度，表明雷公藤多苷具有较好的预防湿疹的作用。

皮肤瘙痒是湿疹的主要临床表现之一，其发生主要通过组胺依赖的痒觉信号通路和非组胺依赖的PAR-2途径共同传递[9]，而TRPV1是两条信号通路共同的下游信号分子，该分子可以通过介导Ca2+的跨膜流动来影响细胞内Ca2+浓度，是痒觉通路传递的枢纽[10-12]。组胺依赖的痒觉信号通路由组胺激活，通过机械刺激不敏感的无髓鞘C-纤维介导，在Ca2+存在下，H1R激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶A2,再活化下游TRPV1通道，使Ca2+内流增加；同时PLC还可水解为二酰甘油而使TRPV1通道开放，从而诱导机体产生痒觉[13-15]。非组胺依赖的PAR-2途径是在机械刺激热敏感的C-纤维介导下由类胰蛋白酶激活PAR-2，活化PLC，使下游TRPV1通道开放；同时活化的PAR-2还可以激活蛋白激酶A，使TRPV1活性增加，诱导机体产生痒觉[16]。本研究结果显示，湿疹大鼠背部皮肤组织中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表达水平升高，提示湿疹瘙痒的产生是H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1通路作用的结果，而雷公藤多苷可以抑制H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表达，从而发挥抗瘙痒的作用。

p38 MAPK作为一个较为保守的丝氨酸/苏氨酸丝裂原激活蛋白激酶，在去磷酸化状态下无活性，只有通过磷酸化改变蛋白质构象后才能与底物和ATP结合，参与细胞衰老、细胞分化、炎症反应等生理过程，也与皮炎、湿疹、类风湿关节炎等疾病的发生密切相关[17-19]。本研究结果显示，湿疹大鼠背部皮肤组织p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平显著升高，提示湿疹的发生与p38 MAPK磷酸化水平相关;而雷公藤多苷可以下调p38 MAPK磷酸化水平，抑制p38 MAPK信号通路激活，从而发挥抗炎作用。

综上所述，H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信号通路在湿疹皮肤组织中均存在异常激活现象，而雷公藤多苷可以通过下调H1R、PAR-2、TRPV1、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平来抑制H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信号通路的激活，从而发挥其抗瘙痒和抗炎的作用，达到预防和减轻湿疹的目的。本研究为雷公藤多苷在湿疹治疗方面的深入开发利用提供了实验依据。