微小RNA-21对脓毒症急性肺损伤小鼠肺组织的修复作用及其与PTEN的关系

葛晨，刘俊行，付优，贾丽静，龙玲，杜全胜

1河北省人民医院重症医学科，石家庄050000；2河北省儿童医院骨科

脓毒症是由感染诱发的宿主炎症失调反应，可导致进行性器官功能障碍，其中最早受损的脏器是肺脏[1]，临床上表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。流行病学研究显示，脓毒症患者中急性肺损伤的发生率达40%，病死率高达40%～50%[2]。脓毒症急性肺损伤的病理机制复杂，包括炎症因子释放、氧化应激、免疫失调等。脓毒症导致免疫细胞群体性过度活化，引起炎症介质肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等过度释放，大量炎症细胞聚集到肺部，导致急性肺损伤[3]。同时，在脓毒症全身炎症反应过程中，炎症细胞被激活，合成和分泌大量活性氧，造成体内氧化—还原失衡，产生氧化应激状态，损伤机体细胞、组织和器官，最终发展为器官功能障碍和衰竭。氧化应激反应与炎症反应相互影响，相互促进，形成炎症—氧化应激的恶性循环[4]。微小RNA(miRNA)是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，它通过抑制靶基因翻译调节蛋白表达，广泛参与人体生长、分化、免疫应答及炎症反应等生理过程，其表达及功能失调与心血管疾病、肿瘤、脓毒症等疾病密切相关[5-6]。研究显示，微小RNA-21(miR-21)在炎症疾病中发挥调控作用[7]，并可通过负向调节磷脂酶和张力蛋白同源物(PTEN)影响细胞分化、生长和凋亡[8-10]。然而，目前miR-21与脓毒症诱导的急性肺损伤是否相关尚不清楚。2019年9月—2020年3月，我们通过建立脓毒症急性肺损伤小鼠模型，观察小鼠肺组织中miR-21的表达情况，并用腺病毒转染方法干预miR-21表达，观察其对肺水肿、血清炎症因子及氧化应激指标的影响，及其与PTEN的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性昆明小鼠96只，体质量(30±5)g，由河北医科大学实验动物中心提供。饲养于清洁级动物房，饲养条件为明暗12 h/12 h交替，温度18～22 ℃，湿度40%～60%，自由进食、饮水。适应性饲养1周后用于实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 载有miR-21前体或抑制剂的腺病毒(美国invitrogen公司)，PTEN抑制剂(Sigma公司，美国)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(杭州联科科技公司)，小鼠活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，TRIzol提取液(美国Ambion公司)，miRNA逆转录试剂盒(美国GeneCopoeia公司)，RT-PCR试剂盒(美国GeneCopoeia公司)，PTEN抗体和羊抗兔抗体(美国KPL公司)。血气分析仪(Premier 3000, 意大利GEM公司)，低温离心机(德国Eppendorf公司)，紫外分光光度仪(日本Shimadzu公司)，反转录仪(美国ABI公司)，Real-time PCR System(美国ABI公司)。

1.2 动物分组干预与模型制备 采用随机数字表法将小鼠分为假手术组(n=32)、模型组(n=32)、miR-21前体组(MP组，n=8)、miR-21抑制剂组(MI组，n=8)、miR-21前体+PTEN抑制剂组(MP+Anti-PTEN组，n=8)、miR-21抑制剂+PTEN抑制剂组(MI+Anti-PTEN组，n=8)。采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症急性肺损伤模型。小鼠术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg进行麻醉。仰卧位固定，腹部备皮、消毒，沿腹正中线切开腹壁约1.0 cm切口，探查分离盲肠，用18号无菌注射器针头贯穿盲肠3次，后将穿刺盲肠还纳至腹腔，并逐层缝合腹部切口。假手术组仅开腹后探查盲肠，不进行穿刺处理；模型组采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症急性肺损伤模型；MP组、MI组于造模前4 d分别经尾静脉注入载有miR-21前体和miR-21抑制剂的腺病毒0.2 mL(1×109pfu/mL)；MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组于造模前4 d分别转染miR-21前体、miR-21抑制剂，于造模前30 min给予尾静脉注射10 μg/kg PTEN抑制剂。

1.3 氧合指数(OI)测算 造模后24 h，每组各取8只小鼠，麻醉开腹，腹主动脉取血1 mL，使用血气分析仪进行血气分析，以氧分压/吸入氧浓度计算OI。

1.4 肺组织湿重/干重比值(W/D)测定 完成血气分析后，取小鼠左肺组织，用吸水纸吸干，置于电子天平称重，记录肺湿重；将肺组织置于70 ℃恒温烘箱干燥48 h再次称重，记录肺干重，计算肺W/D。

1.5 血清炎症因子TNF-α、IL-6和氧化应激指标ROS、SOD检测 造模后24 h，取小鼠腹主动脉血2 mL，静置后4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，取血清-80 ℃保存。采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平，严格按照试剂盒说明书操作。绘制标准曲线和回归方程，测定样品吸光度，代入标准曲线计算样品浓度。

1.6 肺组织miR-21表达检测 采用qRT-PCR法。取假手术组、模型组造模后6、12、24、48 h 各8只小鼠右肺组织，液氮速冻，-80 ℃保存，用于肺组织miR-21表达检测；取冻存的肺组织，应用TRIzol提取肺组织RNA，使用超微量紫外分光光度计检测纯度和浓度，获得高质量RNA。按照miRNA逆转录试剂盒进行逆转录。miR-21引物序列：上游5′-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3′，下游5′-CCTCCA-CAAAGAGCCACC-3′。逆转录条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达量。

1.7 干预miR-21表达对PTEN蛋白表达的调控作用观察 取假手术组、模型组、MP组、MI组造模后24 h的右肺组织，液氮速冻，-80 ℃保存，用于检测miR-21及PTEN蛋白表达。miR-21检测方法参照“1.6”，PTEN蛋白检测采用Western blotting法。取冻存的肺组织，称取100 mg，加入裂解液后充分匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，BCA法测定蛋白质浓度。取100 μg蛋白样品，加入上样缓冲液，沸水变性5 min，电泳后将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入PTEN抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15 min。加入羊抗兔抗体(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显色，用Image J软件测定条带灰度值，以目的蛋白的灰度值与GAPDH的灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组OI比较 假手术组、模型组、MP组、MI组、MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组OI分别为295±28、180±19、225±21、125±13、262±25、256±26。与假手术组比较，模型组OI降低(P<0.05)；与模型组比较，MP组、MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组OI均升高，MI组OI降低(P均<0.05)；与MP组比较，MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组OI升高(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN组与MI+Anti-PTEN组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组肺W/D比较 假手术组、模型组、MP组、MI组、MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组肺W/D分别为4.0±0.4、7.3±0.7、6.1±0.5、9.6±0.8、4.8±0.5、4.9±0.5。与假手术组比较，模型组W/D升高(P<0.05)；与模型组比较，MP组、MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组W/D均下降，MI组W/D升高(P均<0.05)；与MP组比较，MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组W/D下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN组与MI+Anti-PTEN组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比较 与假手术组比较，模型组血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；与模型组比较，MP组、MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)，MI组TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；与MP组比较，MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN组与MI+Anti-PTEN组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组造模后24 h血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比较

2.4 模型组造模后不同时间点肺组织miR-21表达变化 造模后6、12、24、48 h，模型组miR-21表达均较假手术组升高，造模后24 h达到峰值。见表2。

表2 假手术组和模型组造模后不同时间点肺组织miR-21表达比较

2.5 干预miR-21表达对PTEN蛋白表达的调控作用 与假手术组比较，模型组和MP组miR-21表达均升高、PTEN蛋白表达均下降，MI组miR-21表达下降、PTEN蛋白表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，MP组miR-21表达升高、PTEN蛋白表达下降，MI组miR-21表达下降、PTEN蛋白表达升高(P均<0.05)。

表3 干预miR-21表达对PTEN蛋白表达的调控作用

3 讨论

研究发现，多种miRNA在脓毒症中表达异常，其中miR-122、miR-133a、miR-146a变化较为显著，逐步成为早期诊断脓毒症的生物标志物，在脓毒症防治中发挥重要作用[11-13]。研究表明，miR-21参与多种疾病的炎症反应，且存在抗炎作用。miR-21在过氧化氢诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中起保护作用[14]，在动物试验中证实可以减轻高氧性肺损伤[15]。而miR-21在脓毒症急性肺损伤中的表达及如何发挥作用仍未可知。本研究结果显示，脓毒症急性肺损伤小鼠造模后6、12、24、48 h时miR-21表达水平均高于假手术组，24 h达到峰值，提示miR-21参与了脓毒症急性肺损伤的过程。我们对小鼠通过注射载有miR-21前体或抑制剂的腺病毒干预miR-21表达，结果显示，MP组肺组织miR-21表达较模型组升高，MI组肺组织miR-21表达较模型组下降。与模型组比较，MP组OI升高，W/D下降，MI组OI降低，W/D升高，表明增加miR-21表达可减轻脓毒症小鼠肺损伤，而抑制miR-21表达会加重脓毒症小鼠肺组织损伤。

在脓毒症急性肺损伤的发病及病理过程中，免疫反应导致大量炎症介质过度释放。TNF-α是炎症反应过程中出现最早的炎症介质，能激发炎症瀑布效应，促使IL-6、活性氧合成和释放，加重炎症反应；TNF-α可以损伤肺毛细血管细胞，增加血管通透性，导致肺水肿；还可通过直接损伤Ⅱ型肺泡上皮细胞，肺泡表面活性物质减少，进而出现肺泡萎陷[16]，临床出现顽固性低氧血症、难治性呼吸困难、紫绀等症状。本研究结果显示，与模型组比较，MP组血清TNF-α、IL-6水平下降，MI组TNF-α、IL-6水平升高，说明上调miR-21表达可减轻脓毒症小鼠机体炎症反应。既往研究表明，多种miRNA通过抑制炎症因子受体mRNA表达以减少炎症介质的释放[17]，提示miR-21可能通过与炎症通路中mRNA结合促其降解，抑制炎症反应，进一步改善临床症状。

在脓毒症发病过程中，除过度炎症反应外，氧化应激也是脓毒症急性肺损伤的重要发病机制之一，并且与炎症反应相互促进。大量炎症因子激活炎症细胞，导致大量活性氧合成和分泌，形成氧化应激状态。氧化应激对脂类、蛋白质产生强氧化作用，而这些物质是稳定细胞器和生物膜的重要成分，机体细胞的过氧化损伤导致组织缺血、水肿，造成组织器官损伤，进一步发展为器官功能障碍和衰竭。本研究结果显示，与模型组比较，MP组血清ROS、SOD水平下降，MI组血清ROS、SOD水平升高。表明增加miR-21表达可减轻脓毒症相关的炎症反应和氧化应激反应，抑制miR-21表达后炎症反应和氧化应激反应增加。miR-21可能通过减轻脓毒症相关的炎症反应及氧化应激反应，减轻炎症因子及活性氧对肺毛细血管细胞及Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤，增加肺泡表面活性物质的释放，进而减轻肺水肿及肺泡萎陷，使W/D下降、OI升高，改善呼吸困难及低氧血症。

关于人类癌症基因的研究显示，PTEN是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p通过抑制PTEN进而抑制蛋白激酶B(Akt)通路，促进巨噬细胞极化和肺癌细胞凋亡。有研究认为，miR-21-5p可作用于PTEN/Akt信号通路，抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，进而保护肺组织[15]。Akt是一个重要细胞信号转导通路，而PTEN是一种双蛋白脂质磷酸酶，可负性调节Akt信号通路。本研究通过观察miR-21变化对PTEN表达的影响，分析二者之间的关系，结果显示，与假手术组比较，模型组PTEN表达下降；MP组上调miR-21后PTEN表达下降，而MI组下调miR-21表达后PTEN表达增加。这表明在小鼠脓毒症急性肺损伤中PTEN是miR-21的作用靶点。为进一步验证PTEN的作用，本研究采用PTEN抑制剂降低PTEN蛋白表达，结果显示，与MP组造模后24 h比较，MP+Anti-PTEN组、MI+Anti-PTEN组TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D下降，OI升高，说明抑制PTEN后miR-21对减轻炎症反应、氧化应激、改善肺损伤的作用更强，产生了累加效应。而MP+Anti-PTEN组与MI+Anti-PTEN组TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D、OI比较差异无统计学意义，说明PTEN被抑制后，上调或下调miR-21表达对脓毒症中炎症反应、氧化应激、改善肺损伤影响无差异，进一步验证了PTEN确为miR-21的作用靶点。

综上所述，脓毒症小鼠急性肺损伤后肺组织中miR-21表达增加，增加miR-21表达可减轻脓毒症小鼠炎症反应及氧化应激从而减轻肺损伤；而抑制miR-21表达后可加重脓毒症小鼠炎症反应和氧化应激而加重肺损伤，其机制可能是通过抑制PTEN发挥保护作用。