赶黄草中大环多酚大孔树脂纯化工艺的优化

史鹏杰， 黄豆豆， 徐艾娜， 程嘉希， 董志颖， 孙连娜

(上海中医药大学中药学院，上海 201203)

赶黄草是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，主产于四川古蔺，始载于明代《救荒本草》[1],其水提取物主要具备抗脂肪肝、抗肝纤维化及治疗和保护肝损伤的作用[2]，还有一定解酒[3]、降糖[4]、缓解体力[5]、抗衰老[6]的作用。课题组前期研究结果表明，赶黄草中以黄酮苷连接没食子酰基的酚酸类化合物pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose(PHG)、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl-3″-galloyl]-β-D-glucose(PGHG)、thonningianin A具有较强的抗肝纤维化及保肝活性[7-9]，同时三者降糖活性较好[4]，开发前景广阔。大孔树脂作为环保可再生的纯化填料，具有性质稳定、成本低、样品回收率高的特点[10-12]，故本实验以大孔树脂为填料，对赶黄草中大环多酚纯化工艺进行优化，以期为进一步对该该成分的后续开发提供基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；XS105DU、XS104电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Centrifuge5810R高速台式冷冻离心机(德国Eppendolf公司)；N-1300旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)。

1.2 试剂与药物 PHG(批号20181117)、thonningianin A(批号20181103)、PGHG(批号20181103)对照品均为自制，经HPLC归一化法检测其纯度均≥98%。大孔树脂AB-8、D-101、HPD-400(天津正天成澄清技术有限公司)；DM-130、HP-20、HPD-450、HPD-600、HPD-750、BS-30、ABS-21、DA-201(蚌埠市辽源新材料有限公司)；sepLite LX-17、sepLite LX-60、sepLite LX-3020、ztc-1、sepLite LX-12、sepLite XDA-8(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)。赶黄草由四川新荷花中药饮片有限公司提供，批号19050701，经上海中医药大学孙连娜副教授鉴定为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，保存于上海中医药大学中药资源与生物技术研究中心。乙腈为色谱纯(美国赛默飞公司)；甲酸为色谱纯(上海麦克林生化科技有限公司)；乙醇、甲醇为分析纯(德国Greagent公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 大环多酚含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取PHG、PGHG、thonningianin A对照品适量，80%甲醇制成质量浓度分别为0.600 8、0.598 4、0.499 2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取药材适量，80%甲醇溶解制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.5%甲酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，28%～30%A；10～20 min，30%～36%A；20～22 min，36%～39%A；22～30 min，39%～40%A；30～35 min，40%～90%A；35～37 min，90%～28%A；37～40 min，28%A)；体积流量1 mL/min；检测波长280 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.PHG 2.PGHG 3.thonningianin A图1 各成分HPLC色谱图

2.1.4 线性关系考察 将“2.1.1”项下对照品溶液依次稀释2、4、10、50、100倍，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得PHG、PGHG、thonningianin A方程分别为Y=19 108.510 7X-0.055 4(R2=1.000 0)，Y=22 849.421 6X-2.119 0(R2=1.000 0)，Y=23 226.107 9X+6.499 1(R2=1.000 0)，分别在6.01～600.80、5.98～598.40、4.99～499.20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 上样液制备 根据课题组前期优化所得赶黄草中大环多酚的最优提取工艺提取药材，具体方法为将药材切成3～5 cm小段，10倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味(液体体积-药材质量=4∶1)，向浓缩液中加入适量95%乙醇，调节体积分数至30%，4 000 r/min离心20 min，取上清液，即得。

2.3 静态吸附性能考察 取预处理好的大孔树脂抽滤，各精密称取1 g，精密量取20 mL质量浓度为3.85 mg/mL的上样液，在恒温摇床上50 r/min、25 ℃振摇吸附24 h后抽滤，取滤液，测定大环多酚含量，去离子水清洗树脂2次，抽滤至干，精密加入95%乙醇40 mL，在相同条件下振摇解吸24 h，取上清液，测定大环多酚含量，计算吸附率、解吸附率，公式如下，其中C0为上样液中大环多酚初始质量浓度(mg/mL)，C1为吸附后上清液中大环多酚质量浓度(mg/mL)，C2为解吸后上清液中大环多酚质量浓度(mg/mL)，V1为上样液体积(mL)，V2为解析溶液体积(mL)，W为树脂质量(g)，结果见表1。综合考虑吸附、解吸附效果，选择HPD-400型大孔树脂进行动态吸附性能考察。

2.4 吸附考察

表1 不同型号大孔树脂吸附率、解吸附率测定结果

图2 不同上样质量浓度下吸附曲线

2.4.2径高比对吸附效果的影响 取“2.3”项下上样液，调节大环多酚总含量为1.89mg/mL，将其以3BV/h的体积流量通入装有处理好的HPD-400型大孔树脂、径高比分别为1∶4、1∶8、1∶12的色谱柱中，填料质量(体积)分别为12g(20mL)、24g(40mL)、36g(60mL)。每1BV为1个流分，测定流出液中大环多酚总含量，计算泄漏点的吸附率[13]，吸附曲线见图3。由此可知，随着径高比增加泄漏点提前，总吸附率呈降低趋势，故选择1∶4作进一步研究。

图3 不同径高比下吸附曲线

2.4.3上样体积流量 取“2.3”项下上样液，调节大环多酚总含量为1.89mg/mL，将其分别以1、2、3BV/h的体积流量通入装有处理好的HPD-400型大孔树脂、径高比为1∶4的色谱柱中，填料质量(体积)为12g(20mL)，每1BV为1个流分，测定流出液中大环多酚总含量，计算泄漏点前吸附率，吸附曲线见图4。由此可知，上样体积流量较低时吸附率高，但耗时长，故结合生产实际选择2～2.5BV/h作进一步研究。

图4 不同体积流量下吸附曲线

2.4.4上样量 取“2.2.3”项下上样液，调节其大环多酚总含量为1.89mg/mL，将其以2～2.5BV/h的体积流量通入装有处理好的12g(20mL)HPD-400型大孔树脂、径高比为1∶4的色谱柱中，每1BV为1个流分，测定流出液中大环多酚含量直至泄漏点，吸附曲线见图5。由此可知，上样量为10BV时流出液中大环多酚总含量为0.255mg/mL，已超过泄漏点，为减少样品损失，故选择9BV作进一步研究。

图5 不同上样量下吸附曲线

2.5 解吸附考察

2.5.1 洗脱液(乙醇)体积分数 平行装柱(填料质量12 g，20 mL)，按“2.4”项下最优方式上样(大环多酚含量为1.89 mg/mL)，依次加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇各8 BV，以1.0～1.5 BV/h体积流量洗脱，计算洗脱液中大环多酚总量、洗脱部位质量、大环多酚含量，结果见表2。由此可知，大环多酚集中于40%～60%乙醇洗脱部位，含量在19.47%～35.43%之间。

表2 洗脱液体积分数考察结果

2.5.2 杂质洗脱体积分数 平行装柱(填料质量12 g，20 mL)，按“2.4”项下最优方式上样，分别用体积分数为30%、33%、37%、40%、43%的乙醇各8 BV洗脱除杂，收集洗脱液，减压干燥后称定质量，测定大环多酚含量，结果见图6。由此可知，随着乙醇体积分数增加，大环多酚损失率逐渐升高，为了在洗去较多杂质的同时减少损失，选择杂质洗脱体积分数为40%。

图6 杂质洗脱体积分数对大环多酚含量的影响

2.5.3 杂质洗脱液用量 平行装柱(填料质量96 g，160 mL)，按“2.4”项下最优方式上样，40%乙醇洗脱除杂，收集洗脱液，减压干燥后称定质量，结果见图7。由此可知，杂质洗脱液用量为14 BV时亲水性杂质基本被洗脱完全。

图7 杂质洗脱曲线

2.5.4 洗脱剂(乙醇)体积分数 平行装柱(填料质量96 g，160 mL)，按“2.4”项下最优方式上样，14 BV40%乙醇洗脱除杂后分别用体积分数为45%、50%、55%、60%的乙醇各8 BV洗脱，收集洗脱液，检测大环多酚含量，计算其转移率，结果见图8。由此可知，洗脱剂体积分数为50%时，大环多酚含量接近70%，转移率高于50%；随着洗脱剂体积分数进一步增加，转移率升高，但含量明显降低，故综合考虑后确定为50%。

图8 洗脱剂体积分数对大环多酚、转移率的影响

2.5.5 洗脱剂(乙醇)用量 装好大孔树脂柱(填料质量96 g，160 mL)，按“2.4”项下最优方式上样，以体积流量1.0～1.5 BV/h梯度洗脱，先用14 BV 40%乙醇洗脱除杂，再用50%乙醇洗脱，收集1～2、3～4、5～6、7～8、9～10 BV段，减压浓缩至干，称定质量，测定大环多酚含量，结果见图9。由此可知，洗脱10 BV时基本可洗脱完全，故选择其作为洗脱剂用量。

图9 洗脱剂用量对大环多酚含量的影响

2.6 验证试验 称取处理好的HPD-400型大孔树脂2.4 kg(4 L)装柱，调节上样液中大环多酚质量浓度至1.60～2.20 mg/mL(溶液质量浓度约为20 mg/mL)，以2～2.5 BV/h体积流量通入径高比为1∶4的HPD-400型大孔树脂柱中，上样量9 BV，以14 BV 40%、10 BV 50%乙醇依次洗脱，收集50%乙醇洗脱部位，测定大环多酚含量、转移率、得率，平行3批，结果见表3，可知该工艺稳定可靠。

3 讨论

3.1 大孔树脂选择 大孔树脂是一类具有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，性质稳定，是一类理想的纯化填料。本实验中考察了16种大孔树脂，涵盖了非极性、弱极性、中极性、极性、高表面活性5种不同性质的大孔树脂，通过考察静态吸附、解析附以及静态吸附饱和时间，HPD-400型大孔树脂具有较高的吸附率及最高的解吸附率，解吸附效果最佳，赶黄草中大环多酚属极性中等偏大，与HPD-400型大孔树脂性质一致，故选其为纯化填料。

表3 验证试验结果(n=3)

3.2 上样液制备 前期赶黄草药材经提取后浓缩至无醇味，大环多酚在水中溶解度低，呈泥浆状，随溶媒乙醇体积分数升高溶解度增大。根据预实验，该类成分在本实验选择型号大孔树脂下，40%乙醇冲洗即可被洗脱，为了减少该类成分损失，选择30%乙醇溶液作为溶媒。

3.3 结果分析 本实验采用HPLC法测定PHG、PGHG、thonningianin A含量，并以其总含量在所得部位中的占比及其总转移率为指标进行纯化工艺考察。通过3次放大验证此纯化过程，大环多酚洗脱率可达90%，纯化所得产品中大环多酚转移率达50%以上，含量由上样前的8%提高至65%以上，得率为6.56%，RSD均小于5%，说明该型号大孔树脂较为适用于赶黄草中大环多酚成分的纯化，且环保可重复利用，成本低，为赶黄草中该类成分的进一步开发研究提供了有力支持。