甘露子化学成分及其对鼻黏膜上皮细胞的影响

2022-01-27张灵敏李静波蔡纪堂郑琳靖

中成药 2022年1期

张灵敏，李静波，蔡纪堂，郑琳靖

(河南省中医院，河南郑州 450002)

甘露子为唇形科水苏属植物甘露子StachyssieboldiiMiq.的全草，又称地牯牛、草石蚕、旱螺蛳、地环儿等[1]，主要分布于山西、河北、河南、山东、山西等地，其药性甘平，具有润肺补肾、活血散瘀、清热利湿的功效，用于肺炎、肺结核、风热感冒、气喘、黄疸、小便短涩[2]，主要化学成分包括黄酮类、有机酸类、三萜类、甾体类[3]，具有抗氧化、抗菌、抗疲劳、抗肿瘤等作用[4]。郭淑云等[5]报道，甘露子对创伤黏膜组织具有显著的修复作用。本研究对甘露子90%乙醇提取物进行分离、纯化，得到15个化合物，均为首次从甘露子中分离得到，其中化合物1、5可提高鼻黏膜上皮细胞的相对存活率。

1 材料

PT2025型超导核磁共振仪(瑞士Metrolab公司)；Daltonics1300型质谱仪(德国Bruker Daltonics公司)；60～100、300～400目柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)；UV-3000型暗箱式紫外分析仪(上海昶钲电子科技有限公司)；UHT87Y型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；NYJ96型超声波清洗器(山东新玛自动化科技有限公司)；XY-2C型分析天平(常州德普纺织科技有限公司)；BSA116S型全自动离心机(济南欧莱博电子商务有限公司)。SephadeX LH-20凝胶(瑞典Pharmacia公司)。苯环喹溴铵(上海闪谱生物科技公司)；二甲基亚砜(DMSO，山东瑞港化工有限公司)；噻唑蓝(MTT，广东翁江化学试剂有限公司)。所用试剂均为分析纯。

甘露子采自河南省郑州市，经河南中医药大学第二附属医院李静波教授鉴定为甘露子StachyssieboldiiMiq.的全草。

2 提取与分离

取干燥的甘露子21.4 kg，粉碎后加入90%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并上述提取液，减压浓缩得甘露子总浸膏2.6 kg，超声分散在水中，采用石油醚、二氯甲烷、丙酮和正丁醇依次萃取，减压回收溶剂，得石油醚部分浸膏(Fr.A)173.6 g、二氯甲烷部分浸膏(Fr.B)186.2 g、丙酮部分浸膏(Fr.C)217.3 g、正丁醇部分浸膏(Fr.D)251.4 g。取Fr.B，经硅胶柱分离，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (50∶50∶0～30∶70∶0～10∶80∶10)梯度洗脱，得到7个流分Fr.B1～Fr.B7，Fr.B2 (7.8 g) 经硅胶柱，以石油醚-二氯甲烷-丙酮 (40∶60∶0～20∶80∶0～10∶80∶10)梯度洗脱，得到8个组分Fr.B2-1～Fr.B2-8，Fr.B2-2 (843 mg) 经硅胶柱，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (30∶60∶10) 洗脱，得化合物3(27 mg)、6(21 mg)；Fr.B2-4 (649 mg) 经硅胶柱，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (20∶70∶10)洗脱，得化合物8(16 mg)、10(25 mg)；Fr.B2-5 (437 g) 经硅胶柱，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (10∶80∶10)洗脱，得化合物1(22 mg)、7(19 mg)；Fr.B2-7 (624 mg) 经Sephadex LH-20柱，以甲醇洗脱，得化合物11(21 mg)。取Fr.C，经硅胶柱分离，以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (80∶20∶0～30∶70∶0～20∶70∶10) 梯度洗脱，得到5个流分Fr.C1～Fr.5，Fr.C3 (9.3 g) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (80∶20∶0～30∶70∶0～20∶70∶10)梯度洗脱，得到7个组分Fr.C3-1～Fr.C3-7，Fr.C3-2 (763 mg) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (10∶80∶10)洗脱，得化合物2(18 mg)、5(34 mg)；Fr.C3-4 (591 mg) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (30∶60∶10)洗脱，得化合物4(19 mg)；Fr.C3-6 (341 mg) 经结晶、重结晶，得化合物15(26 mg)，Fr.C4 (11.5 g) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (70∶30∶0～20∶80∶0～10∶80∶10) 梯度洗脱，得到6个组分Fr.C4-1～Fr.C4-6，Fr.C4-2 (473 mg) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (10∶80∶10)洗脱，得化合物13(19 mg)；Fr.C4-4 (316 mg) 经Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇洗脱，得化合物12(23 mg)。取Fr.D，经硅胶柱分离，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(20∶80∶0～10∶80∶10～0∶60∶40)梯度洗脱，得到6个流分Fr.D1～Fr.D6，Fr.D3 (815 g) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(10∶90∶0～10∶80∶10～0∶50∶50) 梯度洗脱，得到6个组分Fr.D3-1～Fr.D3-6，Fr.D3-2 (514 mg) 经硅胶柱，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (10∶80∶10)洗脱，得化合物14(23 mg)；Fr.D3-4 (613 mg) 经Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇洗脱，得化合物9(23 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色胶状，ESI-MSm/z：266.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.92 (1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，6.71 (1H，d，J=7.6，1.6 Hz，H-6)，6.58 (1H，d，J=7.6 Hz，H-8)，6.39 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1)，6.26 (1H，d，J=7.6 Hz，H-3)，3.81 (3H，s，4-OCH3)，2.63 (4H，s，H-9，10)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：108.2 (C-1)，157.3 (C-2)，99.6 (C-3)，161.2 (C-4)，130.2 (C-5)，115.0 (C-6)，156.3 (C-7)，113.7 (C-8)，31.2 (C-9)，31.3 (C-10)，140.1 (C-1a)，116.5 (C-4a)，126.3 (C-5a)，146.1 (C-8a)，55.4 (4-OCH3)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为coelonin。

化合物2：白色胶状，ESI-MSm/z：201.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.69 (1H，d，J=9.6 Hz，H-6)，7.03 (1H，s，H-3)，6.72 (1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，2.52 (3H，s，H-10)，2.38 (3H，s，4-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：113.1 (C-1)，164.5 (C-2)，120.1 (C-3)，150.4 (C-4)，119.2 (C-5)，1322.4 (C-6)，195.7 (C-8)，199.6 (C-9)，28.1 (C-10)，22.4 (4-OCH3)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为1-(2-hydroxy-4-methylphe-nyl)propan-1，2-dione。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z：174.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：9.68 (1H，s，H-7)，7.38 (2H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-2，6)，6.92 (1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，3.81 (3H，s，4-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：129.2 (C-1)，130.4 (C-2)，150.1 (C-3)，160.3 (C-4)，111.4 (C-5)，117.2 (C-6)，56.1 (4-OCH3)，192.8 (7-CHO)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为3-羟基对甲氧基苯甲醛。

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z：272.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：6.46 (1H，d，J=9.6 Hz，H-13a)，5.48 (1H，d，J=7.6 Hz，H-13b)，4.25 (1H，m，H-8)，4.05 (1H，t，J=9.6 Hz，H-4)，0.97 (3H，d，J=9.6 Hz，H-14)，0.81 (3H，s，H-15)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：45.1 (C-1)，26.4 (C-2)，30.4 (C-3)，83.7 (C-4)，44.3 (C-5)，36.5 (C-6)，47.4 (C-7)，83.4 (C-8)，44.7 (C-9)，31.7 (C-10)，139.1 (C-11)，170.4 (C-12)，119.3 (C-13)，20.5 (C-14)，19.3 (C-15)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为2-desoxy-4-epi-pulchellin。

化合物5：白色胶状，ESI-MSm/z：176.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：6.58 (1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，6.15 (1H，m，H-5)，5.76 (1H，s，H-2)，5.41 (1H，ddd，J=9.6，7.6，1.6 Hz，H-8)，5.03 (1H，m，H-6)，3.25 (1H，m，H-7b)，1.72 (1H，m，H-7a)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：175.4 (C-1)，114.0 (C-2)，164.2 (C-3)，121.7 (C-4)，140.3 (C-5)，64.8 (C-6)，39.2 (C-7)，79.3 (C-8)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为aquilegiolide。

化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z：190.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.63 (1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，7.35 (1H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-6)，6.85 (1H，d，J=7.6 Hz, H-2)，3.72 (3H，s，7-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ: 119.5 (C-1)，116.2 (C-2)，148.4 (C-3)，145.1 (C-4)，122.6 (C-5)，114.3 (C-6)，167.2 (C-7)，53.6 (7-OCH3)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为3，4-二羟基苯甲酸甲酯。

化合物7：白色粉末，ESI-MSm/z：599.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：5.43 (1H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-6)，5.02 (1H，d，J=9.6 Hz，1-Glc)，1.22 (3H，d，J=9.6 Hz，21-CH3)，1.14 (3H，s，19-CH3)，0.85 (3H，s，18-CH3)，0.69 (3H，d，J=7.6 Hz，27-CH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：32.8 (C-1)，28.1 (C-2)，75.2 (C-3)，40.1 (C-4)，139.2 (C-5)，122.4 (C-6)， 33.1 (C-7)，32.4 (C-8)，47.6 (C-9)，38.2 (C-10)，22.4 (C-11)，39.4 (C-12)，40.8 (C-13)，58.1 (C-14)，31.7 (C-15)，82.6(C-16)，62.5 (C-17)，17.1 (C-18)，20.4 (C-19)，43.1 (C-20)，16.1 (C-21)，111.2 (C-22)，34.1 (C-23)，30.1 (C-24)，33.5 (C-25)，68.1 (C-26)，18.2 (C-27)及1个葡萄糖 (δ：101.1，76.2，80.6，73.1，81.2，64.3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为3-epi-diosgenin-3-β-D-glucopyranoside。

化合物8：白色粉末，ESI-MSm/z：351.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.86 (2H，d，J=9.6 Hz，H-2′，6′)，7.69 (1H，d，J=9.6 Hz，H-7)，7.22 (1H，dd，J=7.6 Hz，H-6)，7.18 (2H，d，J=7.6 Hz，H-2)，6.92 (2H，d，J=9.6 Hz，H-3′，5′)，6.75 (1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，6.43 (1H，d，J=9.6 Hz，H-8)，5.79 (2H，s，H-8′)，3.76 (3H，s，10-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：126.3 (C-1)，111.7 (C-2)，149.5 (C-3)，151.6 (C-4)，117.4 (C-5)，124.1 (C-6)，146.3 (C-7)，117.2 (C-8)，167.4 (C-9)，129.1 (C-1′)，130.2 (C-2′)，114.2 (C-3′)，164.3 (C-4′)，114.2 (C-5′)，130.2 (C-6′)，191.5 (C-7′)，66.2 (C-8′)，56.3 (10-OCH3)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为4′，8′-二羟基苯乙酮-8-O-阿魏酸酯。

化合物9：黄色油状，ESI-MSm/z：207.3[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：6.73 (1H，s，H-2)，6.57 (1H，s，H-5)，6.46 (1H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-6)，3.37 (2H，s，H-7)，3.12 (3H，s，9-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：127.4 (C-1)，116.8 (C-2)，146.8 (C-3)，143.1 (C-4)，115.1 (C-5)，122.5 (C-6)，40.9 (C-7)，76.2 (C-8)，54.2 (9-OCH3)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为3，4-二羟基苯乙酸甲酯。

化合物10：白色结晶，ESI-MSm/z：509.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.93 (1H，d，J=9.6 Hz，H-2)，6.72 (1H，d，J=7.6 Hz，H-8)，6.37 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，6.19 (1H，d，J=7.6 Hz，H-3)，5.31 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″)，5.08 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1′)，3.93 (1H，dd，J=7.6，1.6 Hz，H-2″)，3.79 (2H，m，H-6′)，3.71 (1H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-2′)，3.51 (1H，t，J=7.6 Hz，H-3′)，3.42(1H，m，H-5′)，3.27 (1H，dd，J=7.6，1.6 Hz，H-4′)，1.18(1H，d，J=7.6 Hz，H-6″)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：131.2 (C-1)，162.4 (C-2)，113.5 (C-3)，183.7 (C-4)，164.1 (C-5)，102.3 (C-6)，165.1 (C-7)，97.4 (C-8)，160.2(C-9)，107.3 (C-10)，99.2 (C-1′)，80.4 (C-2′)，83.6 (C-3′)，72.3 (C-4′)，79.1 (C-5′)，63.5 (C-6′)，102.8 (C-1″)，73.1 (C-2″)，74.5(C-3″)，72.6 (C-4″)，69.3 (C-5″)，19.2 (C-6″)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为5，7-dihydroxychromone-7-O-neohesperidoside。

化合物11：黄色粉末，ESI-MSm/z：278.6[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.38 (2H，t，J=9.6 Hz，H-3，5)，7.24 (2H，t，J=9.6 Hz，H-2，6)，7.06 (1H，t，J=9.6 Hz，H-4)，4.85 (1H，d，J=9.6 Hz，H-glc-1)，3.92 (1H， dd，J=9.6，7.6 Hz，H-glc-6a)，3.24～3.81 (5H，m，H-glc-2，3，4，5，6b)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：161.4 (C-1)，16.2 (C-2)，127.4 (C-3)，120.8 (C-4)，127.4 (C-5)，116.2 (C-6)，99.7 (C-glc-1)，72.8 (C-glc-2)，75.6 (C-glc-3)，70.2 (C-glc-4)，77.1 (C-glc-5)，61.2 (C-glc-6)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为phenyl β-D-glucopyranoside。

化合物12：黄色针晶，ESI-MSm/z：339.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：8.17 (2H，d，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，6.93 (2H，d，J=7.6 Hz，H-3′，5′)，6.28 (1H，s，H-6)，3.41(3H，8-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：115.4 (C-1)，147.1(C-2)，135.8 (C-3)，175.3 (C-4)，156.4 (C-5)，100.2(C-6)， 156.3 (C-7)，129.1(C-8)，150.2(C-9)，103.8 (C-10)，124.1 (C-1′)，129.6 (C-2′)，115.3 (C-3′)，159.3 (C-4′)，115.3 (C-5′)，129.6 (C-6′)，62.1 (8-OCH3)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为8-甲氧基山萘酚。

化合物13：黄色片晶，ESI-MSm/z：351.3[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：13.17 (1H，s，5-OH)，7.93 (2H，d，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，7.18 (2H，d，J=7.6 Hz，H-3′，5′)，6.39 (1H，d，J=1.6 Hz，H-8)，6.28 (1H，d，J=1.6 Hz，H-6)，3.82 (3H，s，4′-OCH3)，3.79 (3H，s，7-OCH3)，3.71 (3H，s，3-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：179.1 (C-1)，163.2 (C-2)，161.6 (C-3)，162.4 (C-4)，155.1 (C-5)，156.2 (C-6)，139.4 (C-7)，129.7 (C-8)，121.4 (C-9)，113.6 (C-10)，105.4 (C-11)，96.3 (C-12)，93.4 (C-13)，56.2 (3-OCH3)，55.7 (7-OCH3)，60.8 (4′-OCH3)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为5-羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮。

化合物14：黄色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：363.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：7.91 (1H，d，J=7.6 Hz，H-2)，6.72 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，6.47 (1H，d，J=7.6 Hz，H-8)，6.17 (1H，d，J=7.6 Hz，H-3)，4.96 (1H，d，J=7.6 Hz，H-glc-1)，3.72 (1H，dd，J=9.6，7.6 Hz，H-glc-6a)， 3.21-3.64 (5H，m，H-glc-2，3，4，5，6b)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：121.3 (C-1)，157.4 (C-2)，111.2 (C-3)，183.5 (C-4)，162.3 (C-5)，100.4 (C-6)， 164.2 (C-7)，95.1 (C-8)，156.4 (C-9)，107.2 (C-10)，99.8 (C-glc-1)，72.1 (C-glc-2)， 76.3 (C-glc-3)，70.2 (C-glc-4)，75.1 (C-glc-5)，59.4 (C-glc-6)。以上数据与文献[18]基本一致，故鉴定为7-β-D-glucosyloxy-5-hydroxy-chromone。

化合物15：白色粉末，ESI-MSm/z：342.7[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD，600 MHz)δ：5.41 (1H，t，J=9.6 Hz，H-14)，4.91 (1H，brs，H-17a)，4.63 (1H，brs，H-17b)，4.08 (2H，d，J=5.5 Hz，H-15)，1.72 (3H，s，H-16)，1.18 (3H，s，H-20)，0.62 (3H，s，H-18)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ：40.1 (C-1)，19.7 (C-2)，39.2 (C-3)，45.1 (C-4)，57.4 (C-5)，27.5 (C-6)，39.1 (C-7)，149.5 (C-8)，57.2 (C-9)，41.3 (C-10)，21.8 (C-11)，39.2 (C-12)，139.6 (C-13)，123.1 (C-14)，60.2 (C-15)，17.1 (C-16)，107.2 (C-17)，30.4 (C-18)，183.2 (C-19)，13.4 (C-20)。以上数据与文献[19]基本一致，故鉴定为isocupressic acid。

4 化合物对鼻黏膜上皮细胞的影响

选取2021年1月至2月在河南省中医院耳鼻喉科行鼻内镜术患者5例，经知情同意后取其下鼻甲黏膜，生理盐水冲洗，除去表层血及组织黏液后进行粉碎，加入胶原酶，在36.8 ℃下培养4 h，5 ℃、3 000 r/min离心 5 min，吸弃上层清液，加入DMEM培养基，在36.8 ℃下培养4 h，去除成纤维组织，将悬浮细胞置于96孔板中，在36.8 ℃下培养36 h，再用含生长因子的培养基培养8 d。取鼻黏膜上皮细胞，随机分为化合物组(80 mg/L LPS+1、5、10 mg/L化合物)、对照组(80 mg/L LPS+等体积生理盐水)、阳性组(80 mg/L LPS +1 mg/mL苯环喹溴铵)，采用 MTT法[20]测定化合物1、5、12、15对鼻黏膜上皮细胞的影响，将其置于96孔板中，在36.8 ℃下培养36 h后加入LPS+化合物1、5、12、15，80 mg/L LPS+等体积生理盐水，80 mg/L LPS +1 mg/mL苯环喹溴铵，孵育36 h后，加入15 μL含6 mg/mL MTT的PBS溶液，继续孵育4.0 h，移弃上层培养液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻摇匀，在510 nm波长处检测光密度，计算细胞相对存活率，公式为细胞相对存活率=(化合物组光密度/对照组光密度)×100%。结果，5、10 mg/L化合物1及1、5、10 mg/L 化合物5可提高鼻黏膜上皮细胞的相对存活率，见表1。