草莓种子实生苗病毒分子检测

缪军 马秀明 孙杨 兰成云 王俊峰 韩伟

（山东省农业科学院蔬菜研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心，山东济南 250100）

草莓是蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物，染色体基数为x=7。现代草莓栽培品种均属于八倍体凤梨草莓（Fragaria×ananassa Duch.，2n=8），其适应性较强，在世界各地均有栽培，具有较高的营养价值和经济价值。草莓具有生长周期短、结果早、连续坐果能力强、见效快等优点，深受种植者青睐；又因其果实味道酸甜、香气浓郁、外形美观、颜色艳丽而深受广大消费者喜爱[1-3]。

草莓可通过匍匐茎、分株和种子等进行繁殖，生产中主要采用匍匐茎产生子苗的方法繁育草莓苗，这种营养繁殖技术可以保持草莓品种的优良遗传性状。但是，该繁育方法也导致草莓同其他无性繁殖的植物一样，一旦感染病毒就会传染给子代[2-3]。生产上长期采用无性繁殖，导致植株积累了多种病毒，引起草莓叶片皱缩，植株矮化弱小，果实畸形、品质变劣，产量下降等现象，且危害逐年累加[4-5]。目前，已报道的侵染草莓的病毒种类达20余种，其中普遍发生且危害严重的主要有4种，即草莓镶脉病毒（SVBV）、草莓斑驳病毒（SMoV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV）和草莓皱缩病毒（SCV）[2-3，5-7]。

为了探索一套高效、快捷、简便的脱毒方法，研究人员尝试了高温脱毒、超低温脱毒、化学试剂脱毒、微茎尖组织培养脱毒、高温-茎尖培养结合、二次培养脱毒和花药组织培养脱毒等方法[8-10]。同时，为了检验其是否脱除病毒，还要进行无病毒检测鉴定，鉴定方法有指示植物法、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测等[2-3，11-12]。可见，现有的草莓脱毒苗繁育体系虽有了长足的发展，但是其成本高、难度大、技术水平要求高，必须组培快繁结合病毒检测鉴定。因此，有必要探索一套简便、高效、免检的繁育体系，以促进草莓产业健康发展。

SVBV、SMoV、SMYEV、SCV 草莓病毒主要由蚜虫、飞虱、蓟马等传播，也可以通过嫁接和菟丝子传播，但不能通过种子或花粉传播[13-14]。因此，采用种子繁殖可以避免上述病毒传播，但需要克服草莓种子繁殖后代遗传特性不稳定的缺点。荷兰、日本和加拿大等国已开始种子繁殖型草莓新品种的选育和生产[15-16]。本试验旨在探索种子发芽方法，并验证种子实生苗是否携带病毒，以助推种子繁殖型草莓的应用。

1 材料与方法

1.1 植物材料

脱毒草莓材料经茎尖组培脱毒获得，取幼叶若干片。带毒草莓材料为田间采集的病叶。种子实生苗通过如下步骤获得：种子来自田间自然授粉的草莓浆果，品种有章姬、红颜、甜查理和白雪公主。当草莓果实成熟后适时采摘，削下草莓果皮贴在干燥的吸水纸上晾干，3～4 d后，在果皮表面揉搓、采集种子。种子发芽采用直浸法，即在培养瓶中倒入1/4的灭菌水，将种子浸泡其中，3～5 d换1次水，直到发芽、子叶展开。将小苗定植在穴盘或小花盆中，基质浇透水，1穴（盆）定植1株；初期注意保湿，长出2片真叶后正常管理，5～6片叶时采集样品。将上述材料放入液氮或-80℃冰箱中保存备用。

1.2 引物

特异性扩增的引物设计，根据GenBank中NC_001725的基因序列设计和合成针对SVBV的引物，上游为GAATGGGACAATGAAATGAG，下游为AACCTGTTTCTAGCTTCTTG；基于 AJ311875和 AJ3 11876序列设计合成针对SMoV的引物，上游为TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG，下游为 ATTCG GTTCACGTCCTAGTCTCAC；基于NC_003794序列设计合成针对SMYEV的引物，上游为CCGCTGCAG TTGTAGGGTAC，下游为CATGGCACTCATTGGAGC TGGG；基于NC_043064序列，设计合成针对SCV的 引物对 SCV-F（TTCAGGACCTATTTGATGACA）、SCV-R（CATTGGTGGCAGACCCATCA）[5-7]。 用草莓肌动蛋白基因Actin引物（Actin-F GGGTTTGCTGGAG ATGATGC，Actin-R TCTCCTTGCTCATCCTATCAGC）验证反转录的质量[11-12]。研究中所用引物均由上海生工生物技术公司合成。

1.3 RNA的制备

按照试剂盒的说明进行总RNA的提取，所用试剂盒为FastPureRPlant Totol RNA Isolation Kit（Polysaccharides/Polyphenolics-rich）多糖多酚植物RNA提取试剂盒，由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产。

1.4 反转录

按照HiScriptRII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产）说明书进行cDNA第一链合成，置于-20℃条件下保存备用。

1.5 病毒特异性扩增

将反转录产物作为PCR扩增的模板，对每个样品先进行Actin的扩增，确定反转录质量良好后，再分别进行4种病毒的特异扩增。30 μL RT-PCR反应体系：dd H2O 12 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 正、 反向引物各 1 μL，Taq mix 15 μL。 反应程序：预变性 94 ℃2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72℃延伸5 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物、EB染色、凝胶成像仪观察。

1.6 多重PCR扩增

在单一引物对PCR扩增的基础上，同时在一个PCR反应体系中加入多对引物进行扩增反应，对多重RT-PCR体系的扩增参数进行优化处理。

2 结果与分析

2.1 草莓种子直浸法发芽

草莓种子一直浸泡在水中可以正常发芽，不同品种发芽时间不同，有的品种发芽时间为7 d左右，有的2～3个月（图1）。种子发芽后，将小苗定植在盛有基质的穴盘或小花盆中，1穴（盆）定植1株（图2），可以达到获得种子实生苗的目的。

2.2 草莓总RNA的提取及反转录体系的检测

用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取RNA后，再用反转录试剂盒进行cDNA第一链合成，然后以反转录产物为模板，用Actin-F和Actin-R为引物，各样品扩增出了预期891 bp大小的特异片段（图3），说明根据肌动蛋白基因设计的引物适合作为草莓病毒检测的内标。以此基因为内标，一方面可以检测RNA质量和反转录的质量，另一方面可以排除假阴性结果的干扰，提高检测结果的准确性。

2.3 单一RT-PCR检测草莓病毒

根据设计的草莓镶脉病毒（SVBV）、草莓斑驳病毒（SMoV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV）和草莓皱缩病毒（SCV）的特异引物，以反转录合成的cDNA为模板，逐个进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶琼脂糖电泳，能得到单一的清晰条带，SMoV和SVBV大小分别为461 bp和278 bp左右（图3），符合预期目的片段大小。样品1为组培脱毒苗，没有扩增出条带，说明此脱毒苗脱毒比较彻底，未受这4个主要病毒的感染；样品2、3、4为田间病样，样品3、4扩增出SMoV目的大小的条带，说明它们被草莓斑驳病毒侵染；样品2、4扩增出SVBV目的大小的条带，说明它们是草莓镶脉病毒侵染的样品；样品4既能扩增出SMoV条带，又能扩增出SVBV条带，说明此病株可确定为草莓斑驳病毒和草莓镶脉病毒复合侵染的样品；样品5、6、7、8，用这4对引物均不能扩增出条带，说明种子来源的不同品种实生苗都不携带这4种病毒。

用SMYEV和SCV特异性引物对所有样品进行检测，均未扩增出目的片段，说明采集的样品都不含有草莓皱缩病毒和草莓轻型黄边病毒。

2.4 多重RT-PCR检测草莓病毒

根据单一RT-PCR的检测结果，把SMoV和SVBV 4条引物同时加入每一个含不同模板的PCR管中，可同时检测这2个病毒（图3），样品2扩增出SVBV目的大小的条带，样品3扩增出SMoV目的大小的条带，样品4同时扩增出SMoV和SVBV目的大小的条带，检测结果同单一引物分别检测的结果一致。建立了同时检测草莓斑驳病毒和草莓镶脉病毒2种病毒的多重RT-PCR方法。

3 结论与讨论

草莓种子果皮较厚，吸水透气性差，还可能含有导致休眠的抑制物质，其发芽时间和发芽率在不同品种间有很大差异，出苗也不整齐，播种后有的品种仅需10 d就可发芽，有的品种90 d才能发芽[17-19]。本试验把草莓种子始终浸泡在水里，可以保证种子充分吸收水分，同时也可能稀释导致休眠的抑制物质，有利于发芽。此方法的优点是便于操作，可根据发芽的先后顺序依次定植。用此法获得的实生苗可以满足本试验的需求，其是否优于其他发芽方法有待进一步试验。

草莓叶片组织富含多糖类、芳香族的酚类化合物，使其核酸提取比较困难，特别是总RNA的提取，一般提取方法很难奏效，该试验所用适于多糖多酚的试剂盒能较好地解决此问题。总RNA反转录后，先用Actin引物扩增检验质量，扩增效果较好，健康与带病毒试材均可很好地扩增，增加了试验的可靠性，避免了假阴性的出现。

SVBV是DNA病毒，SMoV、SMYEV、SCV是 RNA病毒。单独检测SVBV可以总DNA为模板进行PCR扩增，由于DNA的提取比较简单快捷且成本不高，比较省时省力。SVBV虽然是DNA病毒，但是被侵染的植物组织中存在病毒基因的转录本，因而在同时检测4种病毒时，可以利用RT-PCR进行SVBV的检测，不必再另外提取DNA[20]。虽然SMYEV和SCV特异性引物在本试验缺少阳性对照，但根据已有报道，这些引物是有效的[5-6，12]，也能说明采集的样品中都不含有SCV和SMYEV。再则，多重RT-PCR扩增可减少试剂损耗，缩短操作时间，达到了省时省力的效果[21]。

目前，草莓脱毒技术虽然有了长足的发展，但是利用现有脱毒技术获得的苗木并不能保证完全脱除了病毒。因此，将这些草莓植株作为生产母株之前，还需进行病毒检测鉴定。因此，组培脱毒技术结合病毒检测鉴定技术，其操作环节繁多、难度较大、资源浪费比较严重，需要进一步探索简便、高效、符合生产实际的繁育体系，促进草莓产业健康、持续发展。

日本、荷兰和加拿大等国家，成功培育出遗传特性稳定的种子繁殖型草莓品种[15-16]。种子实生苗培育可以在较小的面积上经过较短的时间获得较多的植株，方法简易、成本低、效率高、适合大规模的专业化生产。这项技术打破了草莓生产只能用匍匐茎育苗的传统观念，既可减少农药使用量，也能很好地控制草莓病害，从而在降低成本、提高效率等方面均有明显贡献，是草莓生产技术的一次革命性突破[15-16]。本试验证明了种子繁育的草莓后代不携带病毒，有助于推动种子繁殖型草莓品种的选育、推广和应用。