HRAS 基因单核苷酸多态性与精神分裂症及非典型抗精神病药物疗效的关联研究

李 睿，曾 端，和 申，沈一峰，李华芳，2，3

1.上海交通大学医学院附属精神卫生中心精神科，上海 200030；2.上海市精神心理疾病临床医学研究中心，上海 200030；3.上海市重性精神病重点实验室，上海 200030

精神分裂症是一种常见的高度异质性重性精神疾病，病程长，常迁延不愈，严重影响患者的生活质量和社会功能，其病因及发病机制至今未明。HRAS原癌基因（HRASproto-oncogene，HRAS）是RAS基因家族三大原癌基因之一，位于人类11号染色体短臂上（11p15.1～p15.3）。该基因编码的RAS 蛋白，又称为P21 蛋白，位于细胞膜内侧，具有鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性，与GTP 和GDP 有很强的亲和性；其控制的下游通路包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 、 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） 以及磷脂酶C（phospholipases C，PLC）通路等，而已有研究提示这些通路与精神分裂症密切相关［1-4］。HRAS在精神疾病中的研究也较多，已经发现该基因与酒精依赖［5］、认知功能［6］和自闭症［7］有关。有关精神分裂症的基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究［8-10］已有不少，然而尚无研究报道中国汉族人群中HRAS基因与精神分裂症及非典型抗精神病药物疗效的相关性。本研究旨在探讨HRAS基因rs11246176 位点多态性与精神分裂症及非典型抗精神病药物疗效的相关性。

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1 对象与方法

1.1 研究对象

2010年11月至2019年12月入组非典型抗精神病药物治疗精神分裂症长期结局的真实世界的多中心临床研究（the Multi-center Real World Clinical Study of Long-term Outcomes for Schizophrenia by Atypical Antipsychotic Treatment，SALT-C）［11］的460 例精神分裂症患者作为病例组。纳入标准：①符合《精神疾病诊断与统计手册（第4 版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，4th edition，DSM-Ⅳ）中精神分裂症诊断。②性别不限，汉族，年龄大于18 周岁。③患者阳性与阴性症状量表（Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS）总分≥60分，处于急性期。④患者正在或将要服用非典型抗精神病药物，包括喹硫平、奥氮平、利培酮、阿立哌唑、齐拉西酮、帕利哌酮、氨磺必利和氯氮平，入组时至少2周服用非典型抗精神病药物种类不变。排除标准：①患者同时参与其他临床研究。②有其他精神疾病。③患者不适合进行本研究的情况，例如同时患有肿瘤、肝功能不全或处于妊娠及哺乳期等。

共纳入386名健康对照者作为对照组，排除精神病史及精神疾病家族史，无物质滥用史及严重躯体疾病。

本研究由上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准（批件号为2010-35），并获得所有受试者或其监护人签署的同意书。

根据PANSS减分率将455例患者划分为有效组132例和无效组323 例。有效组与无效组年龄、性别、PANSS基线评分、发病年龄、病程、用药剂量及基线用药情况方面差异均无统计学意义（均P>0.05，表1）。有效组97 例基线用药患者用药时长9（4～33）年，无效组217 例基线用药患者用药时长16（6～33）年，差异亦无统计学意义（P=0.108）。

1.2 方法

《经济学人》中国专栏的报道并非只有讽刺或消极类，也有一些报道对中国的经济状况或现象持肯定态度。2016年6月11日的中国专栏中，其中有一篇报道了关于温州经济的现状。该报道中包含三则概念隐喻——“对抗金融危机是战争”、“银行是人”和“经济发展是旅程”。在“对抗金融危机是战争”概念隐喻中，金融危机对应于敌人，对抗金融危机对应于战争（例14）。在“银行是人”概念隐喻中，银行逐渐从金融危机的阴影中走出来对应于人逐渐恢复健康（例15）。在“经济发展是旅程”概念隐喻中，用于承担风险对应于勇敢面对旅途中的危险（例16）。

重复测量方差分析结果显示，A 等位基因携带者（AA+AG）在入组26 周后的减分率显著高于GG 基因型携带者，差异有统计学意义（P=0.010，表4）。

采用SPSS 23.0 进行统计分析，定量资料符合正态分布和方差齐性时用±s表示，采用独立样本t检验进行两组间比较；不符合正态分布和方差齐性时，用M（Q1，Q3）表示，采用Mann-WhitneyU检验进行组间比较。定性资料用n（%）表示，采用χ2检验进行比较。采用非条件Logistic 回归进行不同遗传模式下位点多态性与发病风险的相关性分析。采用重复测量方差分析对不同基因型患者在基线、入组13 周和入组26 周时的PANSS 总分及PANSS 减分率进行评估，年龄和性别作为协变量。P<0.05（双侧检验）表示差异有统计学意义。

460 例患者中男性220 例，女性240 例，平均年龄（48.40±18.16）岁，发病年龄（26.45±10.43）岁，平均病程（23.79±15.93） 年，入组时PANSS 总分为（75.30±12.79）分，患者服用的非典型抗精神病药物转换为奥氮平的平均剂量为（14.89±23.76）mg/d。健康对照组中男性292 例，女性94 例，平均年龄（26.39±5.65）岁。2 组性别、年龄差异均有统计学意义（均P=0.001）。患者中有5 例基因分型失败，对照组中3 名基因分型失败，因此将455 例患者和383 名健康对照者纳入后续研究。重复测量10%的样品进行质量控制，结果100%一致。

1.2.1 临床疗效评定 纳入的460 例精神分裂症患者均接受非典型抗精神病药物治疗，根据世界卫生组织药物统计方法合作中心提出的限定日剂量（defined daily dose，DDD）进行了等效剂量转换，统一转换为奥氮平的剂量［12］。药物疗效的评估采用PANSS，在入组时（基线）、入组13 周和入组26 周各评估1 次。评定疗效的指标为PANSS 减分率，其计算公式及界定值均参照相关文献［13-14］，PANSS减分率=（基线得分-终点得分）/（基线得分-30）×100%，将PANSS 减分率≥50%定义为有效，PANSS减分率<50%定义为无效。

为研究沿海钢管板桩码头受力特性，本文以福建泉州某钢管桩码头为实例对象，通过建立二维、三维数学模型，对码头受力特性进行详细分析，并对比两种计算方法的精度。

1.3 统计学分析

运用SHEsis 软件进行哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验以及组间等位基因和基因型分布频率差异检验，运用SNPStats 在线分析软件评估4 种遗传模式（加性、显性、共显性、隐性）下rs11246176 不同基因型与精神分裂症的关联。使用QUANTO1.2.4 计算样本的统计效能，假设患病率为1%［16］，OR值为1.3［17］，最小等位基因频率为0.123［18］，则样本的统计效能为96.26%。

表1的课程设计主要依据多元识读教学法的理论框架、教学模式和独立学院多元识读的教学模型。该教材每单元需分配12学时来完成，本块对涉及的阅读文本进行了详细的课程设计。该表格总共分为5个步骤，并分为6个模块进行相应的指导，分别为任务描述，训练技能，设计重点，模态选择，教学模式和完成形式。

2 结果

2.1 患者临床特征的组间比较

1.2.3 表达数量性状基因座分析 采用基因表达数据库BrainCloud （http：//braincloud.jhmi.edu/）［15］对HRASrs11246176 位点进行表达数量性状基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）分析，探讨不同基因型在大脑中的表达。BrainCloud 数据集由人脑基因组学联盟BrainSeq 建立，是使用Illumina Human 49K Oligo 芯片生成的。HRAS基因rs11246176 位点包含268 例正常高加索人和非裔美国人背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）的样本。

其一，PBL教学模式在调动高职院校学生英语口语训练动力与兴趣方面的作用；其二，PBL教学模式在提高学生英语口语表达能力上的作用与具体表现；其三，PBL教学模式在提高学生综合素质方面的作用。

表1 有效组和无效组间临床特征比较Tab 1 Comparison of clinical features between the responder group and non-responder group

2.2 病例组与对照组rs11246176多态性检测结果

rs11246176 位点分型结果显示其符合HWE （P>0.05）。经分析发现病例组与对照组的等位基因及基因型频率差异无统计学意义（均P>0.05，表2）。病例组和对照组的基因型经非条件Logistic 回归分析，对性别、年龄进行校正后发现在4 种遗传模式下，rs11246176 位点多态性与精神分裂症发病风险无显著关联（均P>0.05，表3）。

表2 rs11246176位点等位基因及基因型频率在不同组别间的比较Tab 2 Comparison of allele and genotype frequencies between the case group and control group

表3 不同遗传模式下rs11246176位点基因型与发病风险的相关性分析Tab 3 Correlation analysis between rs11246176 genotype and incidence risk in different genetic models

2.3 有效组与无效组rs11246176多态性检测结果

有效组中A 等位基因频率显著高于无效组，差异有统计学意义（χ2＝5.943，P＝0.010，表2）。有效组中AA和AG 基因型频率显著高于无效组，差异有统计学意义（χ2＝6.332，P＝0.040，表2）。

2.4 不同基因型患者非典型抗精神病药物治疗效果比较

1.2.2 SNP 基因分型 采用DNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取患者外周血基因组DNA。采用TaqMan检测试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）对HRAS基因rs11246176 位点进行分型。使用标准PCR 进行扩增，PCR 总反应体系为5 µL，包括2.50 µL master mix、2.25 µL DNA 模板和0.25 µL TaqMan 探针。反应条件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，50 个循环。在ABI PRISM®7900 荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上读取结果。

表4 rs11246176不同基因型PANSS总分及减分率的比较（±s）Tab 4 Comparison of PANSS total scores and reduction rates of total scores among different genotypes of rs11246176（±s）

Note: ①Comparison of reduction rates of total scores between AA+AG genotype and GG genotype. ②Comparison of reduction rates of total scores between AA genotype and AG+GG genotype.

PANSS total score/score Time ①②PAA+AG/GG PAA/AG+GG Baseline 13 weeks 26 weeks AA 73.08±10.00 57.46±13.75 55.15±15.56 AG 76.47±11.71 58.38±15.48 61.63±17.93 GG 75.08±13.28 55.15±15.56 64.23±17.11 Reduction rate of total score/%AA-37.01±23.94 42.09±33.87 AG-35.39±40.17 30.99±33.65 GG-31.06±41.33 22.70±34.84 0.672 0.077 0.293 0.010

2.5 eQTL分析

eQTL 分析发现HRAS基因rs11246176 位点在268 例高加索人和非裔美国人的DLPFC 不同基因型的表达水平之间的差异有统计学意义；rs11246176 AA 型HRASmRNA 表达水平最高，其次为AG 型，GG 型表达水平最低（P=0.000，图1）。

图1 基于BrainCloud数据库的HRAS基因rs11246176多态性的eQTL分析Fig 1 eQTL analysis of rs1246176 in HRAS gene based on the BrainCloud database

3 讨论

本研究报道了HRAS基因rs11246176 位点多态性的基因型和等位基因频率在中国汉族正常人群和精神分裂症人群中的分布，以及该位点多态性与非典型抗精神病药物疗效的关系。本研究未发现rs11246176 等位基因和基因型频率在病例组与对照组之间存在差异，但发现了非典型抗精神病药物治疗有效组的A 等位基因频率显著高于无效组，有效组中AA 和AG 基因型频率也显著高于无效组。在治疗的第26 周末，各基因型间PANSS 总分减分率比较结果显示，A 等位基因携带者的PANSS 减分率显著高于GG 基因型。因此，本研究推测rs11246176 位点可能与非典型抗精神病药物的疗效有关，A等位基因携带者的非典型抗精神病药物疗效较好。

HRAS基因编码的蛋白具有GTPase 活性，是生长分化过程中重要信号转导通路的分子开关。早在1996 年Comings等［7］就报道了HRAS基因的缺陷可能影响G蛋白参与的第二信使信号途径，且与自闭症及强迫症这类行为障碍的精神疾病有关［19］。虽然我们的研究未发现HRASrs11246176 多态性在精神分裂症患者和健康对照间的差异，但发现在有效组和无效组间基因型和等位基因频率分布存在显著差异。有学者推测细胞凋亡与精神分裂症的病理生理过程有关［20］，有研究［21-22］发现HRAS基因能够通过PI3K 激活丝氨酸/苏氨酸激酶（PKB/Akt）或激活核因子κB（NF-κB）来保护细胞免于凋亡。我们通过eQTL 分析发现A 等位基因携带者的HRASmRNA 表达水平显著高于GG 基因型，因此我们推测携带A 等位基因的个体可能通过上调HRASmRNA的表达导致原癌基因持续表达，细胞凋亡减少［23］，从而缓解精神分裂症病理生理过程中的细胞凋亡增加现象；已有研究［24］发现精神分裂症患者额叶皮质细胞凋亡增加，且非典型抗精神病药物可以通过改变凋亡反应发挥治疗作用。

本研究也存在一定的局限性。首先，本研究只探索了HRAS基因的rs11246176 位点，没有研究其他位点，结论具有一定的局限性；其次，未将非典型抗精神病药物进行分类，可能导致混杂偏倚；再者，本研究是真实世界研究，故研究入组时并未严格限制患者既往的用药情况，在一定程度上影响结果的确定性。但经分析，有效组和无效组在基线时用药和未用药的比例，以及已用药患者的用药时长差异均无统计学意义。因此，虽然患者服药对结果有一定影响，但我们可以认为rs11246176 位点可能与非典型抗精神病药物的疗效有关。

综上所述，HRAS基因rs11246176 多态性位点可能不是中国汉族人群精神分裂症的发病相关位点，但可能与非典型抗精神病药物疗效有关。