地塞米松对顺铂致斑马鱼毛细胞损伤的保护作用研究

涂钰莹 易英 涂玉梅 龙孝斌

听觉毛细胞的死亡主要是由于听觉创伤、噪音暴露、年龄老化、化学损伤或暴露于某些药物，从而导致永久性的听觉障碍[1]。哺乳动物内耳中的毛细胞对抗癌铂类和氨基糖苷类抗生素药物等化合物敏感。顺铂是临床上治疗多种人类疾病最常用的化疗药物之一，然而由于顺铂治疗后产生的肾毒性和耳毒性以及神经毒性等毒副作用, 尤其是剂量依赖性的顺铂耳毒性，其临床应用受到一定的限制。

糖皮质激素特别是地塞米松被引入肿瘤治疗, 不仅因为其对淋巴细胞有促凋亡的作用, 同时还能治疗因肿瘤引发的水肿、炎症、疼痛及电解质失衡等方面的副作用，更重要的是地塞米松还能预防因药物细胞毒性作用所引发的恶心和呕吐[2,3]， 以及缓解血管内皮水肿、增加内耳血供，所以临床化疗常联合使用地塞米松。既往动物实验表明豚鼠鼓室内注射地塞米松可以抑制脂质过氧化反应，降低耳蜗组织脂质过氧化产物(MDA)含量、增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性，提高内耳细胞清除氧自由基的能力，可减轻顺铂导致的氧化应激状态，达到保护内耳的作用[4]。故本研究拟观察地塞米松能否保护顺铂导致的斑马鱼毛细胞损伤，能否减少因顺铂导致的活性氧产生并抑制脂质过氧化程度，为顺铂耳毒性的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 本实验所采用的野生型AB品系斑马鱼来源于华南理工大学医学院，由基因工程研究所发育生物学教研室所赠。实验开始前挑选成年斑马鱼(雌雄比为2∶1)放置于装有系统水的培育缸内，第二天8：00光源自动打开后，雌雄鱼在灯光刺激下开始进行交配产卵，取出鱼卵清洗干净转移至28.5℃恒温箱内孵育。挑选发育正常的受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼随机分成3组，分别为对照组、顺铂组、顺铂+地塞米松组，每组10条。

1.2主要试剂与仪器 地塞米松(美国Sigma公司)：用1%的二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为25 μmol/L的储备液，-25℃保存；将顺铂粉末(美国Sigma公司)溶解于ddH2O中，顺铂溶液储存浓度为50 μmol/L，置于-20℃避光保存备用；DCFH-DA、DPPP荧光分子探针、FM1-43FX染液(美国Sigma公司)；体式显微镜(Olympus，MVX10)、正置荧光显微镜(Olympus，日本)、荧光定量PCR仪(Roche，LightCycler Nano)。

1.3实验方法

1.3.1顺铂耳毒性斑鱼模型建立及斑马鱼侧线神经丘毛细胞计数 前期研究发现50 μmol/L顺铂处理24小时足够将幼鱼侧线毛细胞破坏彻底而不导致幼鱼活性明显下降[5]，故沿用该浓度时间组合建立斑马鱼顺铂耳毒性模型。对照组幼鱼置于系统水中；顺铂组幼鱼置于50 μmol/L浓度的顺铂溶液中遮光处理24 h；顺铂+地塞米松组幼鱼置于25 μmol/L的地塞米松中遮光预处理24 h，用PBS溶液漂洗幼鱼3次，每次5分钟，再将其置于50 μmol/L浓度的顺铂溶液中遮光处理24 h。待处理结束后，移除顺铂溶液，用PBS溶液漂洗幼鱼3次，每次5分钟；更换新鲜的系统水，然后于移除顺铂后6、12、24、48 h，每组分别取10条幼鱼置于2 μmol/L浓度的FM1-43FX染液遮光处理45 s，移除染液，用PBST溶液漂洗幼鱼3次，每次5分钟；PFA固定2 h，移除后加入70%甘油保存。采用荧光染料FM1-43FX对斑马鱼侧线神经丘毛细胞细胞膜进行特异性染色。在荧光显微镜高倍镜下观察斑马鱼侧线神经丘P1-P9平均毛细胞的数目。

1.3.2ROS水平检测 每组的前期处理按上述步骤操作，每组10条置于盛有系统水的6孔板里，在移除顺铂6 h后，对每组斑马鱼以25 μg/mL的DCFH-DA探针处理，黑暗28.5℃下培养1 h，1 h后用PBST淋洗数次，用0.02%tricaine(MS222)溶液麻醉后置于体式荧光显微镜下拍照，并计算其荧光强度，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。

1.3.3脂质过氧化产物(MDA)测检 同上操作，10条斑马鱼幼鱼置于盛有系统水的6孔板里，每组斑马鱼以25 μg/ml的DPPP处理后，黑暗28.5℃下培养1 h，然后用PBST淋洗数次，用0.02%tricaine(MS222)溶液麻醉后置于体式荧光显微镜下拍照，DPPP在体内与脂质过氧化物反应后发出蓝色荧光，其荧光强度可反映机体内脂质过氧化的程度，计算其蓝色荧光强度，荧光强度与体内MDA含量呈正比。

1.3.4斑马鱼RNA提取 在移除顺铂6 h后分别收集三组胚胎放入 EP 管中，每管约20尾，加入 500 μl Trizol，用一次性1 ml无菌注射器反复抽吸；室温静置 5 min 后，加入 100 μl 三氯甲烷，剧烈振荡 20 s； 离心机最高转速4℃离心 15 min；此时液体分三层,转移最上层水相至新管中，加入等体积异丙醇或两倍体积乙醇，震荡混匀；离心机最高转速4℃离心15 min；去上清，加入 1 ml无RNase的75%乙醇，最高转速4℃离心5 min；去上清，室温静置 3～5 min 晾干，加入30 μl无RNase的H2O溶解RNA；使用微量分光光度计检测RNA浓度，于-80℃保存。

1.3.5斑马鱼幼鱼cDNA的制备 三组均分别取2 μgRNA，加入1 μl Oligo dT；于70℃加热 5 min 后，立即置于冰上冷却；反转录体系包括：Total RNA+Oligo dT≤13 μl、5×buffer 5 μl、dNTP(2.5 mM) 5 μl、RNase Inhibitor 1 μl、Reverse transcriptase 1 μl、DEPC H2O up to 25 μl。反应体系混匀后 42℃孵育 1 h，于-20℃长期保存。

1.3.6抗氧化物酶基因检测 用实时荧光定量PCR(qPCR)检测抗氧化酶基因sodl、catl、gstr的表达水平。qPCR使用2×Master mix试剂盒在Roche实时定量PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸17 s，45个循环。基因相对表达水平用2-ΔΔCt方法计算，内参基因为ef1a。具体引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.4统计学方法 所有数据应用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差的形式表示，采用Levene’s检验进行方差齐性分析，使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验,三组比较采用单因素方差分析，设定P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组斑马鱼侧线神经丘毛细胞荧光染色及计数比较 经FM1-43FX染色后，可见斑马鱼幼鱼体表规律排列着红色光点(图1)，移除顺铂后6、12、24、48 h三组P1-P9神经丘平均毛细胞数目见表2，可见第6、12和24 h时，三组神经丘毛细胞平均计数均有统计学差异(均为P<0.5),顺铂组、顺铂+地塞米松组神经毛细胞平均计数均低于对照组，且顺铂组毛细胞平均计数明显低于顺铂+地塞米松组；移除顺铂后6 h，三组间神经丘毛细胞数目差异有显著统计学意义(P<0.01)；而在移除顺铂后48 h时，顺铂组、顺铂+地塞米松组平均神经丘毛细胞数平均计数虽无统计学差异，但顺铂+地塞米松组神经丘毛细胞平均计数高于顺铂组，表明地塞米松预处理后，能改善顺铂导致的斑马鱼毛细胞损伤。

表2 各组移除顺铂后不同时间神经丘毛细胞平均计数(个，

2.2移除顺铂6 h后各组斑马鱼幼鱼体内ROS免疫荧光染色比较 如图2所示,移除顺铂6 h后，斑马鱼幼鱼体内活性氧含量增加，顺铂组幼鱼荧光强度显著高于其余两组，分别为对照组和顺铂+地塞米松组的2.11倍和1.50倍(P<0.05)；顺铂+地塞米松组荧光强度为对照组的1.42倍(表3)。可见地塞米松有效改善了顺铂导致的活性氧含量增加，进一步说明地塞米松能降低斑马鱼幼鱼氧化应激水平。

表3 各组斑马幼鱼体内ROS、MDA平均荧光强度

2.3移除顺铂6 h各组斑马鱼体内MDA的DPPP荧光染色比较 如图3所示，顺铂组荧光染色最强，其次是顺铂+地塞米松组，染色最强的是对照组；顺铂组荧光强度分别是对照组和顺铂+地塞米松组的3.33倍和1.57倍(P<0.05);但顺铂+地塞米松组荧光强度与对照组差异无明显统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.4移除顺铂6 h后各组斑马鱼幼鱼抗氧化物酶基因sodl、catl、gstr表达比较 如表4所示，顺铂组、顺铂+地塞米松组与对照组相比，cat1基因表达水平明显降低，且顺铂+地塞米松组cat1基因表达水平明显高于顺铂组(均为P<0.05)。；顺铂组sod1基因表达水平低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，顺铂组与顺铂+地塞米松组sod1基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；三组间gstr基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组斑马鱼幼鱼抗氧化基因catl、sodl、gstr相对表达量

3 讨论

顺铂诱导的耳毒性的特征为双侧、不可逆和剂量依赖性听力损失，其最初影响高频并且可能伴有耳鸣[6]。大约60%～80%的顺铂治疗患者听觉阈值升高，15%的患者有明显的听力损失[7]。听力损失主要由毛细胞损伤导致，致毛细胞损伤的因素复杂多样，相关机制也种类不一，最常见的是细胞凋亡或坏死途径，顺铂进入细胞后，主要通过氧化应激和炎症[8]两个过程引起细胞凋亡诱导细胞死亡。成年哺乳动物的听觉毛细胞虽无法再生，但鸡耳蜗毛细胞和斑马鱼侧线毛细胞具有再生能力。毛细胞再生有两种机制，一是通过有丝分裂再生，支持细胞分裂成一个或两个子细胞，再分化为毛细胞；二是通过支持细胞表型直接转化为毛细胞而不进行有丝分裂，这种现象称为直接转分化[9]。本实验中移除顺铂后48小时，可观察到顺铂组斑马鱼侧线毛细胞逐渐恢复至正常，这是因为前期研究已发现神经丘周围支持细胞增殖状态活跃，新增的毛细胞主要由支持细胞增殖后再分化为毛细胞[10]；但在移除顺铂后6、12和24 h，观察到顺铂+地塞米松组单个神经丘毛细胞均数高于顺铂组，且在移除顺铂后6 h观察到与顺铂组相比，顺铂+地塞米松组平均神经丘毛细胞数增加了约2.2倍(P<0.01)，表明地塞米松预处理可明显改善顺铂导致的毛细胞耳毒性。

既往动物实验证明地塞米松在顺铂损伤过程中起保护作用，Dinh等[11]认为地塞米松通过降低氧化应激水平和NADPH-氧化酶-3(NOX-3)水平，在体外保护大鼠Corti外植体器官免受顺铂诱导的听觉毛细胞损失。ROS水平上升使血管内皮细胞分泌不同的细胞因子，从而破坏紧密连接，导致内耳液体内稳态的紊乱，破坏耳蜗潜能，从而导致Corti器官细胞系的凋亡；据报道，糖皮质激素会在内皮细胞之间产生新的紧密连接，从而恢复血管纹中的内皮功能[12]。在本实验中，采取了浓度为25 μM的地塞米松，这是由于Hayward等[13]测试了一系列浓度的地塞米松后，确定了10 μM为最有效但毒性最低的浓度，且浓度在25 μM时经常观察到显著效果，故而在斑马鱼研究中常用此浓度。

DCFH-DA荧光探针本身没有荧光，但能自由穿过细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能轻易穿透细胞膜，故而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成绿色荧光物质DCF，与细胞内活性氧水平成正比；ROS在细胞代谢过程中产生，并被内在细胞清除系统(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶)所还原。ROS的增加导致耳蜗组织中谷胱甘肽和抗氧化酶的消耗，可能导致耳蜗细胞内的超氧化物、过氧化氢和有毒脂质的增加[14]，大量脂质过氧化物产生后可改变细胞膜的通透性，进而导致细胞的结构和功能出现改变。MDA是一种脂质过氧化产物，它在生物体内含量的高低可指示机体内脂质过氧化水平，能间接反映细胞氧化损伤的程度[15]。如上所述，ROS产生增加的最终结果是促进细胞凋亡和细胞死亡，表明ROS在顺铂诱导的耳毒性中起关键作用，对其抑制可以改善顺铂导致的听力损伤[6]。本研究结果显示与顺铂+地塞米松组相比，顺铂组斑马鱼体内活性氧含量和MDA含量分别增加了1.5倍和1.57倍，表明地塞米松可以降低顺铂导致的斑马鱼幼鱼体内活性氧含量和抑制脂质过氧化程度，从而起到保护毛细胞的作用。此外，文中结果显示顺铂组cat1、sod1基因表达水平与对照组相比下调，可能因为顺铂导致斑马鱼组织中O2-增多，过多的O2-不能及时清除，对斑马鱼产生了氧化损伤；而顺铂+地塞米松组gstr基因表达水平与对照组相比虽无统计学意义，但出现不同程度的上调，说明地塞米松的抗氧化作用导致体内部分抗氧化物酶活性增高。

综上所述，本研究结果表明地塞米松可以减弱顺铂导致的斑马鱼毛细胞耳毒性，降低斑马鱼幼鱼体内活性氧含量、抑制脂质过氧化程度，同时可上调部分抗氧化物酶基因活性，从而保护斑马鱼幼鱼毛细胞免受氧化应激的影响。本研究的不足之处在于未能使用地塞米松的抑制剂作为对照，不能完全排除是否有其他因素对实验结果造成影响，在今后的实验中仍需要进一步研究。