基于网络药理学探讨麝香通心滴丸治疗心力衰竭的潜在机制

权 力，牛文豪，赵 健，张艳达，贺治青，梁 春

心力衰竭(heart failure，HF)指因各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和(或)射血能力受损而引起的一组综合征，是各种器质性心脏病的终末期表现，也是心血管疾病中最常见的类型[1]。流行病学调查表明，心力衰竭的发生率随着老龄化的进展逐年上升，且该病的死亡率可达50%，一旦出现心力衰竭，大部分病人心力衰竭呈进行性恶化[2]。目前心力衰竭的临床治疗方法包括药物干预、血运重建及心脏移植等，其中药物干预主要有血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ抑制剂(ARB)、醛固酮受体拮抗剂、β受体阻滞剂和利尿剂等[3-4]。但单纯西药干预存在一定不良反应，尤其是对低血压慢性收缩性心力衰竭，应用ACEI、ARB、β受体阻滞剂等可导致基础血压进一步下降，引发机体各脏器低灌注表现，反而增加病人死亡率[5]。

近年来中医对心力衰竭的研究逐渐深入。中医学将心力衰竭归为“怔忡”“喘证”“痰饮”“水肿”等范畴，认为心力衰竭属本虚标实之证，其中本虚以气虚、阳虚、阴虚为主，而标实则以血瘀、水饮、痰浊为主[6]，故中医治疗多采用益气温阳、活血利水的方法[7]。一些经典的益气活血药物，如黄芪、丹参、人参、红花、益母草、茯苓、葶苈子等，以及芪参益气滴丸、芪苈强心胶囊、生脉注射液等温阳利水药物，已被证明能有效缓解心力衰竭症状并减少副作用[8]。一些研究着眼于寻找新的药物治疗心力衰竭，近年来麝香通心滴丸也越来越多地用于心力衰竭的治疗中[9-10]。麝香通心滴丸的组方是依据《苏沈良方》中的至宝丹和传统名方六神丸加减化裁而来，其药物组成主要包括人工麝香、牛黄、人参茎叶总皂苷、丹参、熊胆粉、冰片、蟾酥等[11]。已有研究证明，麝香通心滴丸可改善心力衰竭病人症状，提高心脏射血分数，延缓心脏重构，并降低心力衰竭相关标志物水平[10，12]。但麝香通心滴丸的成分较多，作用机制较复杂，目前因受各种条件限制未能完全明确，故本研究拟通过网络药理学方法探究麝香通心滴丸治疗心力衰竭的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分及其靶点筛选 应用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/search)检索麝香通心滴丸主要成分：麝香、牛黄、人参叶、丹参、熊胆、冰片、蟾酥。将化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)阈值设为≥30%、类药性(drug-likeness，DL)阈值设为≥0.18筛选有效成分，并使用TCMSP数据库获得这些化合物对应的靶点。

1.2 疾病靶点收集 以“heart failure”为关键词检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，收集与心力衰竭相关的作用靶点。

1.3 筛选靶点并构建化合物-靶点网络 将所筛选出的药物成分对应靶点与心力衰竭相关的全部靶点进行交集，输入Cytoscape 3.6.0软件构建化合物-靶点网络，以明确疾病靶点与药物靶点之间的关系。使用Cytoscape构建的化合物-靶点网络中，每个节点代表基因或分子，节点之间的连接代表这些生物分子与基因之间存在相互作用，节点的度值代表节点与节点相连的数目。

1.4 构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络 为进一步探究靶点之间的相互作用，将交集所得的共同靶点上传至STRING数据库(Version 11.0，https://www.string-db.org/)，构建PPI网络。物种选择为Homo sapiens，其余参数保持默认设置，获取PPI网络。

1.5 分析潜在的生物过程与通路 利用R Project软件及Bioconductor数据库的org.Hs.eg.db程序包将共同靶点的基因symbols转变为Entrez IDs，随后利用ClusterProfiler程序包对网络进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，以寻找潜在的生物过程与通路。设定P<0.05，并按照涉及靶点数目降序排序，获取GO富集分析中分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)和生物过程(biological process，BP)的前10个条目以及KEGG富集的前20条信号通路。

2 结 果

2.1 药物有效成分筛选结果 通过TCMSP、TCMID数据库检索到麝香、牛黄、人参叶、丹参、熊胆、冰片、蟾酥中的化合物共547个，其中麝香59个，牛黄19个，人参叶126个，丹参202个，熊胆28个，冰片32个，蟾酥81个。

以OB≥30%且DL≥0.18为标准筛选出化合物92个，其中麝香5个，牛黄5个，人参叶9个，丹参65个，熊胆1个，冰片3个，蟾酥6个，其中胆固醇为麝香、蟾酥的共有成分，去氧胆酸为熊胆、牛黄共有成分。部分化合物情况见表1。

表1 麝香通心滴丸部分活性成分

(续表)

2.2 共同靶点筛选结果 通过检索GeneCards数据库，得到与心力衰竭相关的作用靶点13 194个。使用TCMSP数据库检索药物中各有效成分对应的所有靶点，经去重共得到靶点154个。将以上靶点进行交集，合并后得到靶点140个，对应的药物有效成分78个。2.3 化合物-靶点网络构建 采用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物-靶点网络图(见图1)。该网络包含78个化合物节点、140个靶点节点和1 075条边，其中红色节点表示来自丹参的化合物，粉色节点表示来自蟾酥的化合物，紫色节点表示来自牛黄的化合物，深绿色节点表示来自麝香的化合物，蓝色节点表示来自人参叶的化合物，黄色节点为多种药物共有的化合物，绿色节点表示靶点。

图1 麝香通心滴丸主要成分-靶点网络图

根据网络拓扑学性质可知，化合物或药物靶点拥有的节点越多，在整个网络中所起到的作用就越关键，因此，本研究筛选节点度较大的节点进行分析。化合物-靶点网络中的部分关键节点及其拓扑学性质见表2。

表2 化合物-靶点网络中的部分关键节点及其拓扑学性质

通过分析化合物节点度值，可见排名前5位的化合物分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮-ⅡA、鼠尾草酚酮，他们分别能与68个、54个、42个、39个、37个靶点蛋白发生作用，其化学结构图详见图2。观察靶点度值可见，排名前5位的靶点有前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、核受体共激活因子1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、电压门控钠通道5α亚基(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A)、β2肾上腺素能受体(adrenoceptor beta 2，ADRB2)、核受体共激活因子2(nuclear receptor coactivator 1，NCOA2)，他们分别能与55个、35个、31个、31个和31个化合物发生相互作用，这一结果体现了中药多靶点的特性。

图2 化合物节点度值前5位化合物结构图(A：槲皮素；B：木犀草素；C：山奈酚；D：丹参酮-ⅡA；E：鼠尾草酚酮)

2.4 PPI网络构建 应用STRING数据库构建PPI 网络，并采用Cytoscape 3.6.0软件可视化(见图3)，其中线段颜色越深代表其互作评分越高。PPI网络图中包含139个节点、1 905条边，同时得到网络中关键靶点的频次。根据“度值>均值”筛选出关键节点19个， 包括：AKT1、CASP3、AR、EGFR、BCL2L1、CCND1、APP、FOS、CASP8、ERBB2、IL6、CASP9、ESR1、EDN1、ACHE、JUN、MAPK1、CCNB1、CDK4。度值最高的是AKT1，度值为82；其次为CASP3，度值为55；AR、EGFR度值均为47；BCL2L1度值为45。度值大的靶点通常在网络调控中起着关键作用，很可能是麝香通心滴丸治疗心力衰竭的关键靶点。

图3 麝香通心滴丸靶点PPI网络

2.5 GO富集分析与KEGG富集分析 GO 富集分析结果(见图4)中，生物过程主要包括细胞对药物的反应(cellular response to drug)、循环系统血管过程(vascular process in circulatory system)、对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、管径的调节(regulation of tube diameter)、血管直径的调节(regulation of blood vessel diameter)等；分子功能主要包括神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶联氨受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、突触后神经递质受体活性(postsynaptic neurotransmitter receptor activity)、肾上腺素能受体活性(adrenergic receptor activity)等，参与了细胞中膜筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、突触后膜(postsynaptic membrane)等区域组成。KEGG富集信号通路(见图5、图6)主要包括：神经活动配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。

图4 麝香通心滴丸治疗心力衰竭的GO富集分析

图5 麝香通心滴丸治疗心力衰竭的KEGG富集分析柱状图

图6 麝香通心滴丸治疗心力衰竭的KEGG富集分析气泡图

3 讨 论

经过筛选，可见麝香通心滴丸主要活性物质包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮-ⅡA、鼠尾草酚酮等。槲皮素、山奈酚主要来源于人参叶，木犀草、丹参酮-ⅡA、鼠尾草酚酮主要来源于丹参等。先前一些研究发现，人参的主要成分人参茎叶总皂苷能够通过清除体内自由基和抗氧化的作用，减轻缺血心肌的再灌注损伤，进一步改善心肌功能[13]；丹参具有活血化瘀、抗凝、扩血管、改善微循环、通脉养血等作用，并能够防止和减轻缺氧心肌超微结构的变化，对缺氧心肌有保护作用，还可改变血液流变学性质，降低血液黏稠度，并能增加心肌收缩力，使心排血量增加，扩张血管，同时使肾动脉血流量增加，尿量增多，从而减轻心脏前后负荷，发挥良好的抗心力衰竭作用[14-15]。此外，麝香通心滴丸中的其他成分，如麝香能够改善血管内皮细胞功能，促进受损心肌细胞代谢水平恢复，拮抗肾素-血管紧张素系统激活，延缓心室重构进程[16]；蟾酥在抗炎、增强心肌收缩力、扩张冠状动脉等方面也具有一定的作用[17]。

现代医学认为心脏能量代谢障碍、心肌纤维化、心室重构及神经内分泌因子改变等是促进心力衰竭的重要因素[18]。麝香通心滴丸具有芳香益气通脉、活血化瘀止痛之功效，通过GO富集分析，可见麝香通心滴丸治疗心力衰竭的主要过程有调节血管直径、改变激素作用、改善代谢等。通过KEGG富集分析可见其涉及的主要通路有神经活动配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、人巨细胞病毒感染通路等。

神经活动配体-受体相互作用通路是神经系统疾病，如抑郁、焦虑、帕金森病中起重要作用的通路[19-20]。神经活性类固醇是神经组织中具有活性的类固醇，可通过与细胞内受体结合而实现其基因作用，增强或抑制神经元的活性[21]。有研究发现该通路在心脏疾病中也起作用，Wang等[22]发现在冠状动脉搭桥手术中，应用七氟醚可通过调节该途径影响γ-氨基丁酸(GABA)受体，实现对心脏的保护作用；Bai等[23]应用蛋白质组学-代谢组学综合分析方法分析心肌梗死SD大鼠血液和左心组织，发现心肌梗死后心肌损伤与此通路密切相关，表明该通路在心脏损伤过程中也起重要作用。一些网络药理学研究也发现使用芪参颗粒[24]、红景天[25]等药物治疗心脏疾病时也涉及此通路，提示麝香通心滴丸治疗心力衰竭时也可能通过此机制发挥作用。

PI3K/Akt通路可参与多种细胞功能调节，如细胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运等，也参与癌症的发生进展，PI3K与生长因子受体[如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体-1(EGFR)、肝细胞生长因子(HGF)等]结合后，可改变Akt的蛋白结构并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物的活性，从而调节多种细胞功能[26]。近年来一些研究也发现，该通路在心血管系统中也起重要作用，Vega等[27]证明PI3K/Akt通路是心脏生理性生长最关键的分子机制，通过运动或基因层面激活PI3K，可产生心脏保护作用并直接对抗病理性心脏生长；Lv等[28]研究发现6-姜辣醇(6-Gingerol，6-G)可通过激活该通路并抑制凋亡改善心肌缺血再灌注损伤；Chen等[29]使用红景天苷处理内毒素(lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠体内外心脏损伤模型，发现该药物可通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径，对内毒素大鼠产生心脏保护作用。以上研究提示PI3K/Akt通路也可能是麝香通心滴丸发挥心脏保护作用的重要途径。

巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一种β-疱疹病毒，其感染可累及宿主机体各器官和系统，病变范围可从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡[30]。CMV感染与冠心病密切相关。一项系统回顾研究表明，巨细胞病毒感染病人未来心血管疾病的相对风险可增加22%，约13.4%的心血管疾病发病率可归因于巨细胞病毒感染[31]；有研究发现CMV感染的内皮细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用：当病毒在血管壁上传播时，可触发动脉粥样硬化斑块中免疫系统激活，并导致内皮功能障碍[32-33]。通过分析CMV感染的相关通路可见其对心脏疾病的发展起到重要作用，这也可能是麝香通心滴丸发挥治疗作用的重要通路。

4 结 论

通过网络药理学分析可见，麝香通心滴丸中的有效成分可能通过神经活动配体-受体相互作用、PI3K/Akt信号通路、人巨细胞病毒感染等机制，对心力衰竭产生良好的治疗作用，未来可通过基础实验研究进一步验证。