过表达FOXB2 对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

梁俊辉 陈泽锐 彭树明 陈善嘉 舒柏荣

目前肝细胞癌（肝癌）是病死率较高的恶性肿瘤之一。尽管近年肝癌的基础和临床研究取得较大进展，但肝癌患者的5 年生存率仍然很低。现有的多种疗法依然具有明显不良反应。寻找早期诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点，对改善肝癌患者的预后是十分必要的。果蝇胚胎中转录调控因子叉头框蛋白（FOX）在控制细胞周期、上皮分化和代谢以及调节免疫系统等许多生物学过程中有重要的作用，且具有肿瘤抑制和潜在致癌的双重作用。FOXB2 是FOX 蛋白家族的重要成员之一，研究显示FOXB2 抑制了胰腺癌细胞Panc-1的恶性表型。FOXB2 在肝癌中的作用笔者尚未见有相关报道，为此进行本研究，旨在阐明FOXB2在肝癌中的作用。

材料与方法

一、试剂与耗材

胎牛血清（FBS）、双抗抗生素、高糖DMEM培养基、Opti-MEM 培养基、Lipofectamine 3000 转染试剂购自赛默飞；细胞培养板（6、24、96 孔板）、Transwell 小室（8 μm）购自Corning 公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、增强型电化学发光（ECL）试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；RNAiso Plus 试剂、TB Green逆转录快速荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂购自宝生物工程有限公司；FOXB2 抗体购自Immunoway 公司；GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnology；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自北京锐抗生物科技有限公司；0.22 μm 的聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore 公司；结晶紫购自Sigma-Aldrich 公司。

二、方 法

正常肝细胞LO2 细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7 细胞购自中国科学院细胞库，采用含10%FBS 的DMEM 培养细胞，添加10 000 kU/L 的链霉素和10 000 kU/L 青霉素于培养基中。于细胞培养箱进行细胞培养，待细胞融合至90%时进行传代，隔日进行细胞换液。

按照说明书应用RNAiso Plus 试剂从细胞中获取总RNA，NanoDrop 测定RNA 浓度。RT 体系为10 μL，模板DNA 产物常规稀释10 倍；采用TB GreenFast qPCR Mix 试剂进行qRT-PCR 检测mRNA 的表达水平。引物由华大基因合成。引物序列：GAPDH 上游5’-CTACACTGAGCACCAGGTG GTC-3’，下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG-3’，产物长度115 bp；FOXB2上游5’-GCTGAGCG ACATCTACAAGTTC-3’，下 游5’-GAATCTTGATG AAGCAGTCGTTG-3’，产物长度119 bp。2法计算目的mRNA 相对表达量，实验重复3 次。

转染空载体质粒的Huh7 细胞为Vector 组，转染FOXB2 重组质粒的Huh7 细胞为FOXB2组；细胞转染的前一日，消化收集细胞，计数后铺于24 孔板；细胞转染当日，取Opti-MEM 稀释质粒；加入Lipofectamine 3000，培养20 min；取Lipofectamine 3000 在Opti-MEM 中 稀 释；将 混 合液加入对应各孔中后摇匀；继续培养48 h 后检测FOXB2 mRNA 和蛋白的表达水平。

预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入RIPA 裂解液裂解细胞15 min。BCA 法测定蛋白浓度。95℃变性5 min，10%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白质，0.22 μm PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，抗体（FOXB2 1∶1000；GAPDH 1∶1000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3 次，每次8 min，抗体室温孵育2 h；TBST洗涤3 次，每次8 min，使用增强ECL 底物在BIO-RAD Chemidoc XRS 凝胶成像系统曝光；使用Image J 进行图像分析。

96 孔板每孔加入100 μL 细胞悬液（含有5×10个细胞），每组3 个复孔，不含细胞的培养基作为空白对照（Vector）；然后分别于预先制定好的检测时间点（24、48、72 h），向检测孔中加入10 µL 的CCK-8 试剂，继续在培养箱中培养2 h，于酶标仪上在450 nm 处测定吸光度（D）。实验重复3 次。

取Vector 对照组和FOXB2 过表达组的细胞以1×10/孔的密度铺板6 孔板，继续培养1 周，4%多聚甲醛固定细胞后用0.2%结晶紫染色，相机拍照并计数克隆个数。实验重复3 次。

按试剂盒说明书将5×10细胞接种在24 孔板中。预定时间收集细胞并将其悬浮在无血清培养基中。迁移能力时将细胞置于未涂Matrigel 胶的上腔室中。侵袭实验测定时将上室的膜按1∶8 稀释并涂Matrigel 胶。所有下腔室均充满500 µL 含25%FBS 的培养基。将细胞置于上室培养24 h 后，在200 倍物镜下使用显微镜在3 个视野中对迁移或侵袭的细胞数量进行计数。

三、统计学处理

使用GraphPad Prism 7 处理数据。结果以表示，2 组比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、LO2、Hep3B、Huh7 细 胞 中FOXB2 mRNA 相对表达量比较

人肝癌细胞系Hep3B、Huh7 细胞的FOXB2 mRNA 表达水平低于人正常肝细胞LO2 细胞（F=321.6，P ＜ 0.001），见图1。

图1 LO2、Hep3B、Huh7 细胞中FOXB2 mRNA 相对表达量比较

二、FOXB2 过表达对Huh7 细胞增殖的影响

转染后的qRT-PCR 检测结果显示，与Vector组细胞相比，FOXB2 组细胞的FOXB2 mRNA（t=21.85，P ＜ 0.001）和蛋白（t=7.19，P=0.002）相对表达量均明显上调，见图2A～C。CCK-8 实验显示，过表达FOXB2 在72 h 明显抑制了Huh7 细胞的增殖能力（t=5.61，P=0.005），见图2D。

图2 FOXB2 过表达效率验证及其对Huh7 细胞增殖的影响

三、FOXB2 过表达对Huh7 细胞克隆形成的影响

平板克隆形成实验结果显示，过表达FOXB2明显抑制了Huh7 细胞的克隆形成能力（t=19.41，P ＜ 0.001），见图3。

图3 FOXB2 过表达对Huh7 细胞克隆形成的影响

四、FOXB2 过表达对Huh7 细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell 迁移实验结果显示，过表达FOXB2明显抑制了肝癌细胞Huh7 的迁移（t=7.32，P=0.002）和侵袭（t=10.58，P ＜ 0.001）能力，见图4。

图4 FOXB2 过表达对Huh7 细胞迁移能力和侵袭能力的影响（结晶紫染色,×200）

讨 论

肝癌仍然是危害人类健康的公共卫生难题之一，在全球范围内仍然有增加的趋势。尽管近年肝癌的诊断和治疗研究方面均取得了长足的进展，但其5 年生存率仍然较低，主要原因为肝癌早期临床表现缺乏特异性，大部分肝癌患者在确诊时已处于中晚期，肿瘤细胞已经发生转移，而转移及相关并发症是造成肝癌患者死亡的主要原因。肝癌患者根治性切除术后5 年累积复发率约为70%，有大约90%的患者因发生转移而死亡。因此，深入研究肝癌的具体分子机制仍然是该领域的重点。

FOX 蛋白家族由一组进化上保守的转录因子组成，其特征是一个共同的DNA 结合域，称为叉头盒结构域。该家族包括19 个亚族，具有翼状螺旋DNA 结合结构域或称叉头结构域，这种结构域具有转录激活和抑制作用，使FOX 具有肿瘤抑制和潜在致癌的双重作用。FOX 蛋白家族参与细胞生长、分化和其他生物过程。FOX 蛋白家族转录因子的解除调控对肿瘤的发生和发展具有重要意义。在人类中，根据序列相似性，FOX 基因被分为19 个亚组。在癌细胞中，许多FOX 基因被认为是抑癌基因或促癌基因。例如，FOXO 和FOXM1转录因子的平衡通过竞争性调节靶基因胰岛素样生长因子，整合了腺苷5’-磷酸腺苷，活化蛋白激酶介导的代谢和细胞周期调节。FOXK1 和FOXK2在调节线粒体功能、代谢和凋亡中起重要作用。作为FOX 家族蛋白的一员，BRAF 突变阳性的结直肠癌中FOXB2 的5’区CpG 岛存在异常甲基化。Fukuchi 等研究显示，FOXB2 在胰腺癌细胞系Panc-1 细胞中低表达，其5’端的CpG 岛高度甲基化，表明FOXB2 可能受到抑制，进一步研究发现FOXB2 抑制了Panc-1 细胞的恶性特征。

本研究显示，与正常肝细胞相比，FOXB2 在肝癌细胞中低表达；过表达FOXB2 抑制了肝癌细胞的增殖和克隆形成能力，同时降低了肝癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究初步探讨了FOXB2 在肝癌中的作用，为后续的研究奠定了一定的基础，但FOXB2 在肝癌中的具体作用机制依然不明确，日后将进一步研究FOXB2 在肝癌中的具体分子机制。为改善肝癌患者的预后，发现新的肝癌药物干预靶点提供理论依据。