芍药苷对PFOS 致小鼠肝脏氧化损伤的保护研究

李赞 严定逸 姜冉 陆康 曹亚利 陈兰华 罗敏 黄春霞

目前，环境污染问题越来越受到重视，其中全氟磺酸类化合物，主要是全氟辛烷磺酸基化合物（PFOS），会对肝脏造成强烈的氧化损伤；因为全氟辛烷磺酸类物质的使用范围非常大，所以在人和动物体内都发现了一定浓度的PFOS，严重危害人类和其他生物的健康。然而，芍药苷作为药物的主要活性物质之一，具有抗氧化损伤和无副作用的特点，通过探索其对PFOS 致肝氧化损伤小鼠模型的保护作用，不仅为其他类型的药物所导致的肝脏损伤治疗提供了借鉴方法，而且为新药物的研制开辟了道路。

材料与方法

一、材 料

生理盐水、蒸馏水、HE 染液、全氟辛烷酸钾（纯度98% 100 g）、芍药苷（纯度98%，HPLC 500 mg）由上海吉至生物科技有限公司生产。益肝灵片（有效成分水飞蓟，规格：38.5 mg/片）由陕西利君现代中药有限公司生产。检测血清ALT、AST、ALP 水平和肝脏丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平的试剂盒由湖南圣湘生物科技有限公司生产。

选择健康雄性昆明小鼠（25～30 g）40 只，小鼠由长沙天勤生物技术有限公司提供。按照实验动物管理委员会制定的环境标准给小鼠自由喂食、饮水，每日定时称重。规律性饲养1 周，随后进行实验。

二、实验方法与流程

给小鼠灌服全氟辛烷酸钾（10 mg/kg，连续灌胃18 d）建立小鼠肝脏氧化损伤模型。40 只小鼠采用随机数表的方式分为模型对照组、阳性对照组、低剂量芍药苷组（低剂量组）、中剂量芍药苷组（中剂量组）及高剂量芍药苷组（高剂量组），分别给予生理盐水、益肝灵片溶液、10 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的芍药苷溶液连续灌胃3 周，每次给药0.1～0.2 mL，分别记录各组小鼠的体质量变化，同时注意各组小鼠的精神行为学有无差异。本实验符合动物实验相关伦理规范。

最后1 次给药后隔24 h，小鼠称重，从小鼠眼球中抽取2 mL 血液，以3000 r/min 的速度进行离心处理，10 min 后提取上清液，检测血清ALT、AST 及ALP 的水平，按试剂说明书和生化分析仪的使用方法进行测定。后立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脏用于制备组织匀浆模型，测定丙二醛、SOD 以及肝脏HE 染色。操作方法为用电子秤称取肝脏组织50 mg 装入无菌试管中，加入预冷的生理盐水，采用冰浴的方法进行匀浆处理，使肝脏中的匀浆液水平达到10%，然后以3000 r/min 的速度进行离心处理，10 min 后提取上清液，按试剂盒要求检测小鼠肝组织匀浆丙二醛及SOD 的活性，其他剩余肝脏组织用甲醛固定后用于病理学检测。

三、统计学处理

结果

一、芍药苷对PFOS 导致的肝脏氧化损伤起保护作用

阳性对照组和低剂量组丙二醛水平与模型对照组比较差异均无统计学意义（P 均＞ 0.05）；相反，高剂量组和中剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义（P 均＜ 0.05）。阳性对照组、低、中剂量组SOD 水平与模型对照组比较差异均无统计学意义（P 均＞ 0.05），高剂量组SOD 水平与模型对照组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表1。

表1 各组小鼠肝脏丙二醛和SOD 水平的比较

与模型对照组相比，阳性对照组、中、高剂量组均能降低小鼠血清ALT、AST 及ALP 的水平（P 均＜ 0.05），与阳性对照组比较，低、中剂量组不能降低血清ALT、AST、ALP 水平，差异均无统计学意义（P 均＞ 0.05），高剂量组可以降低血清ALT、AST 水平，差异均有统计学意义（P 均＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠ALT、AST 及ALP 水平的比较 单位：U/L

二、芍药苷改善了PFOS 导致的肝脏病理学变化

由于PFOS 的存在，导致小鼠的肝脏病理学发生了显著改变，在病理学上表现为肝组织淤血、肝脏局部组织紊乱、细胞及组织水肿、炎症细胞浸润、局部组织坏死，见图1A。在经给予药物益肝灵片以及芍药苷后，肝脏组织损伤得到缓解，肝脏病理学改变明显减轻。随着芍药苷浓度的增加，肝脏修复情况呈现阶梯型变化，图1C、D、E与图1B 对比发现，芍药苷同益肝灵片均能对肝脏损伤起到一定的治疗作用。

图1 芍药苷改善了PFOS 导致的肝脏病理学变化（HE 染色,×400）

三、芍药苷能有效缓解PFOS 对小鼠体质量抑制作用

模型对照组体质量为（35.54±1.82）kg，阳性对照组为（37.96±1.38）kg，低、中、高剂量组分别为（36.19±2.61）（37.55±1.16）（37.86± 1.75）kg，模型对照组相比其他4 组体质量低，以模型对照组为基准，发现除低剂量组外其他3 组差异均有统计学意义（P 均＜ 0.05），表明PFOS 可能对小鼠的体质量增长具有一定的抑制作用，而芍药苷可能在一定程度上能缓解PFOS 对小鼠体质量增长的抑制作用。

讨 论

PFOS 广泛应用于各行各业，PFOS 在广泛运用之时造成了一系列污染问题。PFOS 在生态系统中存活性极强，很难被降解，这是因为其惰性和化学稳定性较强，同时又难以挥发。如 今，已在世界各地的水、土壤、大气、人类和动物的肝脏与血清中检测到它，使其成为威胁环境和人类健康的重要污染物之一。由于通过食物链可以进行研究生物放大和累积影响作用，使位于食物链高层的高级生物体内有高浓度的PFOS 富积。有大量动物毒理学研究表明，PFOS 类有机污染物会对动物健康产生极大危害，其危害表现在诸多方面：首先基因表达不稳定，其次会导致动物发生癌变，还会产生神经、发育、繁殖、免疫、肝的毒性，最后还会引起甲状腺和内分泌异常。其中对肝脏的损害最为严重，其可增加肝细胞内活性氧浓度、肝脏脂褐质含量、导致体内有关抗氧化酶的活性下降、破坏体内的抗氧化系统并造成肝脏氧化损伤。

芍药苷的药理作用包括抗过敏、抗惊厥、抗炎、抗凝血和抗氧化。通过大量研究可以看出，芍药苷能够治疗诸多与肝脏相关的疾病，比如肝脏纤维化、化学性及胆汁性肝脏损伤、脂肪肝甚至肝癌等。芍药苷具有极强的抗氧化特性，能够降低机体内活性氧含量，降低血清及肝组织的ALT、AST 水平，有效增强位于肝组织的SOD、GSH、GSH-PX 的酶生物活性，降低丙二醛、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 等炎症因子的水平。研究显示核因子-κB（NF-κB）调控PNPLA3 表达参与肝脏脂肪变性的进展，而芍药苷可同时抑制IRAK 和NF-κB 相关信号通路的激活，加快凋亡因子Caspase3 的表达；通过PI3K/AKT 信号通路促进Nrf2 的表达，最终从抗氧化、抗炎、抗凋亡多个机制过程保护肝脏。此外芍药苷不仅能够通过刺激小鼠释放血浆纤连蛋白来提高血药水平进而起到保护肝脏的效果，还能够提升网状内皮系统功能来保护肝脏。

通过实验表明PFOS 对肝脏的毒性尤为突出，PFOS 暴露后肝脏中3 种抗氧化酶和丙二醛的活力下降、同时造成肝脏中SOD 的水平增高；致使氧自由基不能被及时清除，而过多的氧自由基可不断攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸而发生氧化作用，使细胞膜完整性遭到破坏，也对小鼠机体的生物大分子以及在细胞水平上造成氧化损伤。在病理上表现为肝脏组织淤血、肝脏局部组织坏死紊乱、肝细胞及组织水肿、炎症细胞浸润等。由于实验动物对PFOS 的肠道吸收率较高，摄入后优先黏附在肝脏中负责转运脂肪酸的蛋白质上。此时因内质网的应激调控以及过多的自由基能使线粒体内一些重要的酶类如脱氢酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶失去活性，肝细胞溶酶体膜渗漏加上细胞蛋白水解阻碍了能量和物质的代谢，更容易引起肝实质细胞的脂滴堆积增加，造成肝脏的脂质代谢紊乱。此外，PFOS 诱导的氧化应激通过抑制AKT/mTOR 信号通路，上调肝脏凋亡相关蛋白抑制 Nrf2 通路相关的蛋白表达水平，引起细胞自噬和凋亡，进一步加重细胞损伤。

PFOS 可增加肝细胞内活性氧浓度，降低体内抗氧化酶活性，破坏抗氧化防御系统，并增加肝脏脂褐质含量；介导脂质过氧化反应降低机体抗氧化防御能力，诱发肝细胞 DNA 损伤。而芍药苷通过PI3K/AKT 信号通路促进Nrf2 的激活，发挥抗氧化和抗炎能力的功能，Nrf2 通过上调可抑制氧化应激及肝星状细胞的生成；同时激活还原型辅酶Ⅱ使一氧化氮、氧自由基的生成减少；提高肝组织SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力，从根源上对PFOS 的毒性机理进行抑制，完成对PFOS 造成的化学性肝损伤的保护作用。

综上所述，在给予药物以及芍药苷治疗之后，小鼠血清ALT、AST、ALP 水平以及肝脏组织丙二醛水平随之降低；SOD 水平增高；且肝脏的病理学改变在一定程度上得到恢复，并存在一定的剂量反应关系；其中高剂量组与阳性对照组相比，高剂量组的效果更佳。由此可知，药物芍药苷与药物益肝灵片同样可起到保护肝脏的作用，在一定程度上芍药苷的效果更佳。