基于FD-GC-O 和OAV 法分析不同处理的黄瓜汁关键活性成分差别

谭梦男，潘少香，孟晓萌，刘雪梅，郑晓冬，吴茂玉，宋 烨，曹 宁，闫新焕

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250014）

黄瓜（Cucumis sativusL.）是葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物，具有美容、抗过敏之效，还有通经、活血、解毒、利尿等生理作用[1-2]。我国黄瓜的总产量占全球总产量的81%，是全球最大的黄瓜生产国。黄瓜作为世界上十大热量最低的蔬菜之一（16 Kcal/100 g），具有独特的风味，脆嫩的质地，深受全球各国人民的喜爱。随着消费水平的提升，人们对产品多样性及质量要求不断提高，促进了黄瓜精深加工产业的可持续发展，黄瓜汁产品应运而生。鲜榨黄瓜汁以其清爽的口感、清新的香气越来越受到人们欢迎，市场占有率越来越大。但黄瓜汁中的香气成分多为热敏性物质，受温度影响较大，在杀菌过程中，加热处理会导致美拉德等反应，使相关香气物质发生变化产生异味甚至不良风味，因此目前黄瓜汁仍未实现工业化生产。

气相色谱-嗅闻技术（GC-O）是将人体感官分析与仪器检测相结合，从复杂的混合物中筛选和评价气味活性物质贡献大小的一种有效方法[3]。目前用于客观性评价单一香气组分的感官贡献大小的GC-O 方法大体分为3 类：稀释阈值法（dilute to threshold analysis，DTA）、直接强度法（direct intensity analysis，DIA）和频率检测法（frequency detection analysis，FDA）[4-5]。与其它两种方法相比，FDA 方法可以用最少的时间确定化合物香味属性，分析结果具有较好的重复性，是应用较普遍的一种GC-O 分析方法。依据该方法得出，一种气味物质的检测频率（detection frequency，DF）越大，其香气贡献就越大。香气活性值（OAV）是香气化合物浓度与阈值的比值，能确切地评价单一香气成分对整体香气的贡献作用，一般认为OAV≥1 的物质对整体香气的呈现有贡献作用[6-7]。将GC-O 技术与香气强度法相结合，可以更快速地筛选出样品特征香气化合物，香气强度越大，对整体香气的贡献越大[2]。

本文利用频率检测-气相色谱-嗅闻技术（FD-GC-O）和香气活性值法（OAV）对鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁的挥发性成分进行分析，鉴定黄瓜汁关键活性成分，为优化黄瓜汁加工工艺、提升黄瓜汁品质提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

曲堤黄瓜，采摘于济南市济阳区曲堤街道郭家村蔬菜大棚。

氯化钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；2-辛醇，色谱纯，德国Dr.Ehrensorfrt GmbH 公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅，HH-4，江苏省金坛市正基仪器有限公司；破碎机，UM5，德国STEPHAN 公司；蒸汽灭菌器，YXQ-LS-100A，上海博迅实业有限公司；气相色谱-质谱联用仪，TRACE 1300-ISQ，美国Thermos 公司；电子天平（精度0.01 g），PL2002，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；20 mL 顶空进样瓶，HM-2075G，浙江哈迈科技有限公司；50/30μm萃取头，DVB/CAR/PDMS，美国supelco 公司；嗅闻仪，PALRSI，德国GERSTEL 公司。

1.3 样品制备

1.3.1 工艺流程

黄瓜→挑选→清洗→破碎打浆→压榨→均质→加热（95 ℃）杀菌→冷却→成品

1.3.2 操作要点

挑选无病虫、无腐烂、新鲜的黄瓜，用流动的清水洗净，放入破碎机中破碎，经纱布过滤，得到黄瓜汁；均质，在95 ℃下杀菌30 s，冷却后，置于4 ℃下贮藏备用。鲜榨黄瓜汁不经过杀菌处理，以此作为对照。

1.4 样品前处理

HS-SPME 处理：称取5.00 g 黄瓜汁样品于盛有1 g氯化钠的20 mL 顶空瓶中，并加入32.88 μg/mL 的2-辛醇20 μL 作为内标。将顶空瓶加盖密封后，放入三位一体自动进样器上，待测。

1.5 挥发性成分检测方法

采用GC-O-MS 系统对黄瓜汁挥发性香气成分进行分析。GC-O-MS 是由气相色谱、质谱和嗅闻装置组成。样品经进样口解析后，经GC 分离后分别进入质谱检测器和嗅闻检测器，分流比为1∶1。嗅闻人员在嗅闻口记录所闻到的香味特征和保留时间。

1.5.1 自动进样器条件

选择SPME 进样模式，样品孵化时间5 min，振摇速度 为 450 r/min，孵化温度为40℃；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 纤维萃取头（萃取前按照说明进行老化处理）的萃取深度为18 mm，萃取时间35 min，萃取温度40 ℃，萃取时振摇；进样深度为35 mm，脱附时间300 s后，进行GC-MS 分析。

1.5.2 GC-MS 分析条件

GC 条件：DB-5MS色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；采用程序升温模式，起始温度为40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min 升温速率升至180 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min 升温速率升至250 ℃，保持3 min，进样口温度为250 ℃；以氦气（纯度99.999%）为载气，流速为1.666 mL/min，不分流进样。

MS 条件：电子轰击离子源（EI），EI 电子能量70 eV；离子源温度250 ℃，GC/MS 传输线温度250 ℃；扫描方式为全扫描，质量扫描范围50～600 mau。延迟2 min。

嗅闻条件：气相毛细管柱末端以分流比为1∶1 分别连接质谱和嗅闻仪。气味输出通过无涂层填充的色谱柱，色谱柱温度设定为220 ℃，在嗅闻口处对气体进行加湿，防止因气体干燥引起嗅闻人员不适。黄瓜汁中香气组分的鉴定由10 名嗅闻人员来完成。所有嗅闻人员对GC-O 有一定的实验基础，实验前经过知识培训、标准品嗅闻、样品感官和GC-O 上机实验等培训等，嗅闻过程中要求嗅闻人员记录香气物质出现的时间，并对其香气属性进行准确描述。以每种物质被10 名闻香人员所嗅闻到的总次数作为它们的DF，来表征每种物质的香气贡献大小。本实验中，将DF≥5 的物质确定为关键香气成分。

1.5.3 定性与定量

定性方法：通过正构烷烃C5～C20进行挥发性组分的线性保留指数（linear retention index，LRI），并与已发表文献中的LRI 进行匹配，然后利用GC/MS 工作站软件Xcalibur 自带NIST 标准库自动检索各组分质谱数据，结合质谱裂解规律确定其化学成分，仅对能予以定性的物质（SI 和RSI 值大于800）进行探讨。

定量方法：使用内标法定量，2-辛醇（32.88 μg/mL）为内标，并根据加入内标的含量从而计算样品中每一个挥发性香气物质的含量，计算公式见式（1）。

式中，Ci为物质i的含量，mg/kg；cs为内标物s 的浓度，μg/mL；V为加入内标物s 的体积，mL，Ai和AS分别为待测组分i和内标化合物s 的峰面积；m为称取的黄瓜汁样品质量，g；Fi为待测组分i对内标s 的相对质量校正因子；本实验中各待测组分i的相对校正因子均为1[8-9]。

1.5.4 关键香气活性物质分析

在各种挥发性组分定量的基础上，参考文献[10]中各物质在水中的香气阈值，计算该物质的OAV值。OAV为挥发性化合物质量浓度与该物质嗅觉阈值的比值，通常用OAV 表示呈香物质在香气中起作用的强度，当OAV≥1 时，认为该香气物质可能对食品香气的贡献和影响较大，OAV＜1，则表明该物质对总体香气无实质性贡献，一般情况下，OAV 越大则说明该物质对总体香气的贡献越大[11]。因此，本研究把OAV≥1 作为黄瓜汁特征香气成分的判别标准[7]，其计算公式见式（2）。

式中，OAVi表示挥发性成分i的气味活度值；Wi表示每个挥发性成分的含量，mg/kg；Qi表示挥发性成分i在水中的气味阈值，mg/kg。

1.6 数据分析

采用Microsoft excel 2019 软件处理数据并作图，每组数据平行测定10 次，结果表示为“平均值±标准偏差”的形式。

2 结果与讨论

2.1 鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁挥发性成分种类及含量

利用HS/SPME-GC-MS 方法测得鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁的挥发性风味物质，见表1，总离子流图如图1（见下页）所示。共发现22 种化合物，其中醛类物质10 种，醇类物质7 种，酮类物质1 种，酯类物质1种，酸类物质1 种，其他物质2 种。结果表明，黄瓜汁主要香气成分为能够赋予黄瓜青鲜气的不饱和C6、C9的醛、醇。定量结果表明鲜榨黄瓜汁中醇类物质含量高达3.972 6 mg/kg，其中，反-2,顺6-壬二烯醇含量最高，而加热杀菌后的黄瓜汁中醇类物质含量仅为0.206 9 mg/kg；加热杀菌后的黄瓜汁中醛类物质含量高达3.460 2 mg/kg，其中反-2-,顺-6-壬二烯醛含量最高，而鲜榨黄瓜汁中醛类物质含量为0.192 9 mg/kg。鲜榨黄瓜汁中检出的化合物含量超过0.1 mg/kg 的化合物有乙醇（0.12 mg/kg）、醋酸（0.23 mg/kg）、正己醛（0.11 mg/kg）、正壬醇（0.45 mg/kg）、顺式-3-壬烯-1-醇（0.10 mg/kg）、(Z)-6-壬烯-1-醇（1.32 mg/kg）、反-2,顺6-壬二烯醇（1.83 mg/kg）。加热杀菌后的黄瓜汁中含量超过0.1 mg/kg 的化合物为壬醛（0.101 7 mg/kg）、(Z)-壬-2-烯醛（0.67 mg/kg）、反-2-,顺-6-壬二烯醛（2.325 2 mg/kg）。这与其他学者的研究结果基本一致。尚明月等[12]报道黄瓜中含有较多的(E)-6-壬烯醛和壬醛，具有独特的水果香甜风味，其中‘南水8 号’反-2-,顺-6-壬二烯醛含量最高，黄瓜风味最为浓郁。王春芳等[13]发现采用反,顺-2,6-壬二烯醛和己醛的含量测定进行黄瓜汁的气味评价是较为可靠的。

图1 鲜榨黄瓜汁（a）和加热杀菌后的黄瓜汁（b）总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram diagram of fresh cucumber juice(a) and heated sterilized cucumber juice(b)

表1 鲜榨黄瓜汁与加热杀菌后黄瓜汁中挥发性组分的定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in fresh cucumber juice and heated sterilized cucumber juice

2.2 鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁挥发性成分FD-GC-O 与OAV 分析结果

表2 中列出了嗅闻人员采用GC-O 法从黄瓜汁中嗅闻到的活性化合物，共计15 种，以醇类物质和醛类物质居多。黄瓜汁整体嗅香主要表现为青草香的主香，并伴有果香及花香。所有嗅闻人员均嗅闻到的活性化合物（DF=10）为反-2-,顺-6-壬二烯醛及反-2-,顺-6-壬二烯醇且均被描述为“清香、黄瓜味”。除此之外，鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后黄瓜汁中正己醛、2-己烯醛及反,反-2,4-庚二烯醛均被绝大多数嗅闻人员描述为“青草香”。在鲜榨黄瓜汁中有部分嗅闻人员嗅闻到的活性化合物有(+)-柠檬烯（清香味、柠檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）。加热杀菌后黄瓜汁中嗅闻到的活性化合物数量明显少于鲜榨黄瓜汁，且(+)-柠檬烯（清香味、柠檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）及醋酸（酸味）物质未被嗅闻到。分析其原因是加热杀菌使黄瓜汁中一些热稳定性较差的香气物质破坏，因而导致杀菌后黄瓜汁中香气物质种类及数量降低[14]。

表2 鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁挥发性成分FD-GC-O 与OAV 分析结果Table 2 Results of volatile components FD-GC-O and OAV of fresh cucumber juice and cucumber juice after heating sterilization

利用OVA 法从鲜榨黄瓜汁中鉴定出7 种关键活性化合物（OAV≥1），分别为正己醛、(+)-柠檬烯、顺式-4-庚烯醛、醋酸、壬醛、反-2-,顺-6-壬二烯醛及反-2-,顺-6-壬二烯醇。其中反-2-,顺-6-壬二烯醇OAV 值最高为1 827；从加热杀菌后黄瓜汁中共鉴定出5 种关键活性化合物（OAV≥1），分别为正己醛、顺式-4-庚烯醛、壬醛、反-2-,顺-6-壬二烯醛及反-2-,顺-6-壬二烯醇，其中反-2-,顺-6-壬二烯醇加热杀菌后OAV 值急剧降低至68，而反-2-,顺-6-壬二烯醛OAV 值升高至232，说明反-2-,顺-6-壬二烯醇加热杀菌后发生复杂的化学反应，导致其含量急剧降低，推断发生氧化反应，部分反-2-,顺-6-壬二烯醇脱氢生成反-2-,顺-6-壬二烯醛。另外加热杀菌导致醋酸及(+)-柠檬烯OAV＜1，说明加热杀菌在一定程度上造成香气损失。一般情况下，DF 值与OAV 值呈对应关系，即DF 值越高，OAV 值越大，该物质的活性越大[5]，对黄瓜汁的整体贡献也越大，如反-2-,顺-6-壬二烯醛及反-2-,顺-6-壬二烯醇。但也有特殊情况，如鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁中2-己烯醛虽然OAV＜1，但因与其它物质间存在协同效应，在嗅闻过程中仍被识别到，因此对黄瓜汁香味贡献大的物质相对含量并不一定大，仅从相对含量来比较不同成分对香味的贡献是不准确的，需要结合阈值才能得出更真实的结果[15]。

3 结论

根据GC-MS 检测结果，鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁共发现22 种化合物，其中醛类10 种，醇类7种，酮类1 种，酯类1 种，酸类1 种，其他类别2 种，鲜榨黄瓜汁和加热杀菌后的黄瓜汁主要香气成分为能够赋予黄瓜青鲜气的不饱和C6、C9的醛、醇，其中鲜榨黄瓜汁中正己醛、(+)-柠檬烯、壬醛、醋酸、反-2-,顺-6-壬二烯醛、反-2-,顺-6-壬二烯醇具有较强的香气活性（OAV≥1）易被大多数人识别（DF≥5）；加热杀菌后的黄瓜汁中具有较强的香气活性（OAV≥1）易被大多数人识别（DF≥5）的物质为正己醛、壬醛、反-2-,顺-6-壬二烯醛、反-2-,顺-6-壬二烯醇。因此正己醛（青草味）、壬醛（花香）、反-2-,顺-6-壬二烯醛（黄瓜味）、反-2-,顺-6-壬二烯醇（清香、黄瓜味）是黄瓜汁的关键活性成分。