阿柏西普对小鼠角膜碱烧伤后新生血管的抑制效果及机制探讨*

李维纳，林超群，阳 昇△，陈光胜

(1.柳州爱尔眼科医院青白科，广西 柳州 545005；2.中国科学院大学深圳医院西院区神经外科，广东 深圳 518107)

角膜新生血管(CNV)，可由感染、化学伤及退行性病变等引起的炎症和缺氧形成，其降低角膜透明性，还常导致角膜瘢痕化和持续性炎症，严重影响视力，是严重威胁视力的致盲性眼病[1-3]。已有大量实验研究证实，血管内皮生长因子(VEGF)在角膜碱烧伤后新生血管的发生、发展中发挥重要作用[4-5]。VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子[6]，导致角膜缘血管扩张、渗透性增加，血管内皮细胞迁移至细胞外基质，形成新生血管，VEGF家族包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF及胎盘生长因子(PLGF)，因此抑制VEGF表达是抑制新生血管生成的关键所在。阿柏西普(aflibercept)为全人源化融合蛋白类抗VEGF药物，可紧密结合VEGFA、VEGFB和PLGF，已有大量文献报道，阿柏西普在治疗眼底病理性新生血管相关疾病有明显疗效，也能明显减轻视网膜静脉阻塞继发的黄斑水肿，且已在临床推广[7]，而其对CNV的作用，鲜少报道。本实验通过观察结膜下注射阿柏西普对小鼠CNV、VEGF的表达及角膜炎症的作用，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 阿柏西普眼内注射溶液(艾力雅)购自德国拜耳公司；兔多克隆VEGFA(ab46154)和VEGFB(ab110649)抗体，ELISA试剂盒购自美国abcam公司；β-actin 抗体(#4970)购自美国Cell Signaling Technology公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(abs20002)购自上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立及分组 36只健康昆明小鼠(雌雄不限，体重25～35 g，购自广东医科大学实验动物中心)，于裂隙灯显微镜观察眼部情况，排除眼部疾病；实验过程遵循 ARVO制定的相关规定；碱烧伤及结膜下注射过程，采用0.6%戊巴比妥钠，腹腔注射，诱导全身麻醉，0.5%丙美卡因滴眼液表面麻醉，每次取12只小鼠，随机分为A、B 两组，每组6只。用打孔器制作直径为2 mm的单层滤纸片，A、B两组用移液器滴2 μL浓度为1 mol/L的NaOH溶液于滤纸片上，浸泡1 min后贴敷于小鼠右眼角膜中央，30 s后弃掉，立即用生理盐水冲洗结膜囊1 min；用移液器滴2 μL生理盐水于滤纸片，置于两组小鼠的左眼，其余步骤同前，作为碱烧伤对照[8]。模型建立模完毕后按造模顺序立即在A、B两组球结膜下分别注射阿柏西普注射液和生理盐水各20 μL(用Hamilton微量进样针注射)；术闭涂左氧氟沙星眼膏预防感染。

1.2.2角膜的形态学观察 观察 A、B两组小鼠，于碱烧伤后1、3、7、14、21、28 d观察小鼠角膜新生血管情况，计算CNV面积并拍照记录。CNV面积[9]：分别测量小鼠角膜4个象限内最长的血管长度，计算CNV面积(A)，A=C/12×3.1416[r2-(r-1)2]，C为CNV累积角膜的圆周钟点数，l为血管长度，r=1.4 mm为小鼠角膜半径，CNV总面积为4个象限面积之和。

1.2.3角膜炎症指数评分(IF) 根据睫状充血程度、中央角膜及外周角膜水肿程度评分[10]：(1)睫状充血:无充血为0分，充血血管小于1 mm计为1分，充血血管1～<2 mm计为2分，充血血管大于2 mm计为3分；(2)中央角膜水肿：无水肿计为0分，有水肿、虹膜纹理可辨计为1分，有水肿、但虹膜纹理不清计为2分，有水肿、看不清瞳孔计为3分；(3)外周角膜水肿:无水肿计为0分，有水肿、虹膜纹理可辨计为1分，有水肿、但虹膜纹理不清计为2分，有水肿、看不清虹膜计为3分。IF为3项得分总和除以9，评分过程由同一人完成，重复3次。

1.2.4Western blot检测 采用Western blot检测 VEGFA、VEGFB的表达 A、B两组小鼠(每组随机取3只)，于碱烧伤后第14天处死，取角膜组织，置于预冷的装有蛋白裂解液(RIPA)(按 1∶100 加入蛋白酶抑制剂)的EP管中，用电动研磨仪匀浆后，再用组织超声破碎仪进行超声破碎(冰上操作)，离心，取上清，提取蛋白样品，采用Western blot[11]检测VEGFA、VEGFB的表达,使用ChemiDocTM Touch化学发光成像系统显影、照相，图片用Image J软件定量分析。

1.2.5组织病理检测 组织病理检测A、B两组小鼠(每组随机取3只)，于碱烧伤后第14天处死，沿角膜缘剪取角膜组织，放入福尔马林溶液固定24 h后，石蜡包埋，冷却后切片(厚约5 μm)，石蜡切片HE染色，透明树脂封片后镜检。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 应用ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-10的表达 A、B两组小鼠，于碱烧伤后第14天处死，取角膜组织，置于预冷的装有匀浆液的EP管中，用电动研磨仪匀浆，然后用组织超声破碎仪处理(冰上操作)。对样本加样孔对应的标本做好编号，ELISA步骤按试剂盒说明书操作。终止反应后，15 min内，用酶联免疫测定仪测定OD450值。绘制标准曲线：标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线。算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度(pg/mL)。

2 结 果

2.1碱烧伤后小鼠CNV面积和IF评分 A、B两组小鼠敷贴生理盐水滤纸片处理后角膜无改变(图1)。碱烧伤后第1天时A、B两组角膜均有新生血管芽长入，角膜上皮出现缺损，基质水肿，两组的CNV面积和IF差异均无显著性(P=0.072、0.140)；从第3天开始，角膜缘血管明显扩张，角膜水肿加重，两组的CNV面积和IF均表现出差异，A组CNV和IF明显小于B组(P=0.022、0.037)；第14天时，B组新生血管生长最为旺盛，呈树枝状，已长入角膜中央区，面积最大，角膜透明性最差，A组新生血管明显较B组细小、稀疏，新生血管未长入角膜中央区；2周后，角膜水肿明显减轻，IF逐渐降低；第14、21、28天时A组面积明显小于B组,差异均有统计学意义(P=<0.001、0.002、<0.001)，且第14天时两组间差异最大(图1，表1、2)。

表1 碱烧伤后CNV面积

图1 A、B两组分别于1、3、7、14、21、28 d时，角膜新生血管情况

2.2角膜碱烧伤后14 d VEGF表达情况 由于第14天时，A、B两组CNV面积差异最大，因此取第14天的角膜组织行VEGFA和VEGFB蛋白的表达，A组VEGFA和VEGFB的蛋白表达水平明显低于B组，差异均有统计学意义(P=0.003、0.028)(图2)。

表2 角膜碱烧伤后IF评分分)

注：a:P<0.05,b:P<0.01；n=3。

2.3苏木精-伊红(HE)染色 角膜碱烧伤第14天，B组角膜基质层明显增厚，结构疏松，纤维排列欠规则，胶原纤维肿胀弯曲，可见新生血管管腔，管腔内可见红细胞，炎症细胞浸润明显；A组角膜各层组织结构较整齐，上皮层未见明显空泡，新生血管管腔较B组少，基质层可见少量炎性细胞浸润(图3)。

图3 碱烧伤后14 d时角膜HE染色(200×)

2.4角膜碱烧伤第14天炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的表达 由于第14天时，A、B两组CNV面积差异最大，因此取第14天的角膜组织检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的表达，A组角膜TNF-α、IL-6和IL-10的表达量均明显低于B组，差异均有统计学意义(P=0.016、<0.001、0.002)。见表3、图4。

表3 炎症因子表达量

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001；n=6。

3 讨 论

角膜碱烧伤后CNV形成机制尚不十分明确，其过程可能为：碱烧伤后角膜组织发生炎症反应，释放大量炎症细胞，中性粒细胞诱导活性氧溶解角膜各层组织，而且组织局部缺氧，使缺氧诱导因子-1(HIF-1)产生，并调控 VEGF 作用于血管内皮细胞，使其大量增殖[12-14]；角膜碱烧伤后，免疫机制的参与，促进多种免疫细胞因子IL-6、IL-10等表达增加，SAKAMOTO等[15]发现炎性细胞因子与碱烧伤后角膜组织的炎性反应程度呈正相关；炎症细胞还可以释放大量的自由基，激活胶原酶，降解细胞外基质，使血管内皮细胞向刺激源移行，形成成熟稳定的新生血管[16]。

针对新生血管发生机制的药物种类繁多，但很多药物的不良反应在治疗过程中逐步证实，比如糖皮质激素。阿柏西普是通过DNA技术由人血管内皮生长因子受体(VEGFR)胞外结构域(即VEGFR1Ig2区和VEGFR2Ig3区)与人IgG1的Fc结构域融合后形成的同源二聚体糖蛋白，生物活性更持久，具有较好的抗新生血管作用。其作为抗肿瘤药物,作用于靶点VEGF A、VEGF B和PLGF，降低血管内皮细胞通透性，抑制肿瘤血管的生成[17-19]。研究证明，阿柏西普较雷珠单抗、贝伐单抗等同类抗新生血管药物作用强[20-21]。已有大量临床研究报道，玻璃体腔注射阿柏西普，对湿性老年性黄斑变性[22]、病理性近视[23]、视网膜静脉阻塞黄斑水肿[24]和糖尿病视网膜病变黄斑水肿[25]均有良好的治疗效果，抑制视网膜新生血管生成，减缓眼底病变的发展，阿柏西普减轻黄斑水肿效果更好，提高患者的视力，且安全性也得到广泛证实，但其对小鼠角膜新生血管的抑制作用、治疗效果、并发症等方面缺乏实验室及临床证据。

眼部给药的方式包括结膜囊滴眼、结膜下注射，角膜基质注射等。滴眼液的配制涉及浓度、给药频次，需要大样本动物实验摸索；临床上阿柏西普治疗眼底疾病通过注射的方式到达眼内，需要一定的时间才发挥作用，小鼠滴眼后会立即出现眨眼、流泪，药物在结膜囊存留时间短，恐难发挥作用；碱烧伤后，角膜炎性水肿，角膜基质注射会加重角膜组织损伤。因此本研究采取结膜下注射的给药方式观察阿柏西普抑制CNV的疗效。碱烧伤后第1天时阿柏西普对新生血管的抑制作用无显著差异，但从治疗后第3天开始出现对新生血管的抑制作用，第14天时治疗组对角膜新生血管的抑制作用最为明显。随后作者对第14天的角膜组织VEGFA和VEGFB的蛋白表达检测发现，在阿柏西普治疗组二者表达水平均显著下降。碱烧伤后，细胞发生皂化反应，导致角膜上皮缺损，基质层胶原纤维间隙变大、排列紊乱，角膜水肿、混浊，甚至溶解、坏死。本研究发现，对照组小鼠角膜水肿和混浊程度较重，阿柏西普治疗后，角膜组织各层水肿和混浊程度减轻，炎症指数降低。有研究表明,TNF-α、IL-6、IL-10及基质金属蛋白酶参与角膜碱烧伤后的炎性反应，与新生血管的生成呈正相关，TNF-α、IL-6和IL-10是公认的检测的较多的炎性细胞因子，抑制新生血管，其表现出下降趋势[26-27]。本研究也检测到炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的表达量表现出明显降低。因此，本研究认为结膜下注射阿柏西普通过抑制VEGFA和VEGFB的表达，减轻炎性反应，从而减小碱烧伤后角膜CNV面积、缩小血管管径，提高大部分患眼角膜透明性，且注射2周时治疗效果教对照组最为明显，之后CNV面积逐渐较少，新生血管萎缩、退化，角膜水肿和混浊不同程度减轻。

临床应用前景：(1)结膜下注射阿柏西普对碱烧伤后角膜新生血管有明显抑制作用；(2)结膜下注射阿柏西普短期安全性好，操作简单、方便；(3)未发现眼局部及全身不良反应。不足之处：由于观察时间有限，阿博西普结膜下注射后，是否需像治疗眼底新生血管一样根据病情多次注射，新生血管是否会复发，复发的规律等仍需多中心、大样本、长期的实验研究或临床观察，以便更客观评价其治疗效果。