基于硬组织切片染色的颈椎钩椎关节的解剖研究

李梓瑜，刘宇航，史 君，曲星月，袁宏伟，李 琨，陈 杰，李筱贺，王海燕，和雨洁，李志军，张少杰，王 星

(1.内蒙古医科大学研究生院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学基础医学院生理学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学基础医学院病理学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学基础医学院解剖学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110；5.内蒙古医科大学数字医学中心，内蒙古 呼和浩特 010110)

钩椎关节作为颈椎特有解剖结构，对维持人体颈椎正常生理活动起重要作用，其结构受损可造成各类颈部疾病。钩椎关节位于C2～C6椎体后外侧，由后部两侧的小唇状椎体钩和相应的椎体下斜坡构成[1-2]。钩椎关节特殊的解剖位置使其在颈椎的运动及疾病中扮演着重要角色。在颈椎活动范围内，其外侧关节的相关运动是颈椎独特的活动特征[3-4]。钩椎关节的主要作用在于维持颈椎运动单元的稳定性和活动性，承受应力负荷，防止椎间盘向外侧或后外侧突出[5-6]；其压缩作用表现为在椎间孔处压迫神经根，以及钩椎关节的骨赘侧唇压迫椎动脉[7]。故钩椎关节受损所带来的一系列不良影响在临床上具有重要研究价值。

经检索文献发现，以往对钩椎关节的研究多为探讨其解剖结构，从而得到应用于临床方面的结论。例如：仝苗苗[8]利用影像学技术测量颈椎钩椎关节的主要组成结构及其相邻骨性结构的形态学参数，分析青少年颈椎组成结构的生长变化特点；王晓刚等[9]利用超声检查方法与图像特征对颈椎重要骨性标志及毗邻结构进行研究，提供了具有实用价值的超声引导下颈部结构影像资料；王星等[2]对3岁儿童尸体标本颈椎进行连续切片并用苏木精—伊红染色，观察学龄前期儿童钩椎关节组织的发育特点，得出学龄前期儿童的颈椎尚未形成钩椎关节的结论。但是目前极少有学者对钩椎关节进行组织结构的细致研究，因此无法确定钩椎关节内部组织成分，无法分析其在生长发育过程中组织形态方面的变化，本研究即针对这一问题展开了观察与分析。

目前采用苏木精—伊红染色结合甲苯胺蓝染色、番红—固绿染色及阿尔新蓝过碘酸雪夫等染色法可以全面客观地观察到目标结构的组织形态特征[10]。故本研究利用苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色对成人钩椎关节进行观察，并对钩椎关节的解剖结构进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象与主要试剂、仪器

选取1例成年男性全颈椎标本，截取C2～C6钩椎关节进行脱水固定包埋。苏木精—伊红试剂盒，甲苯胺蓝试剂盒，光固化机，德国EXAKT300CP硬组织切片机，德国EXAKT400S磨片机，福尔马林液，梯度乙醇(70%～95%)，无水乙醇，Technovit 7200树脂液，320目、800目、1 200目、4 000目砂纸。

1.2 方法

标本经福尔马林液固定48 h后流水冲洗24 h，行梯度乙醇(70%～95%)上行脱水(每步24 h)，入无水乙醇+Technovit 7200树脂液(配制比3∶7)浸液浸泡2 d，入无水乙醇+Technovit 7200树脂液(配制比1∶1)浸液浸泡2 d，入Technovit 7200树脂液浸泡7 d后，再入Technovit 7200树脂液浸泡3 d，于光固化机中包埋聚合。将标本组织块取出，使用德国EXAKT300CP硬组织切片机对组织块进行不脱钙联合切片，切片厚度为200 μm，以德国EXAKT400S磨片机依次使用320目、800目、1 200目砂纸将切片磨至厚度为25 μm，最后以4 000目砂纸对打磨好的切片进行抛光。

苏木精—伊红染色：骨组织切片经梯度乙醇复水，浸入苏木精染色3～8 min，流水冲洗，浸入1%盐酸酒精30 s进行分化，水洗，蒸馏水过洗，0.6%氨水反蓝，流水冲洗，切片入伊红染液中染色1～3 min，蒸馏水稍洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，将切片从二甲苯中取出稍晾干，中性树胶封片。

甲苯胺蓝染色：骨组织切片经梯度乙醇复水，甲苯胺蓝染色约30 min，自来水冲洗，冰醋酸分化至细胞核清晰，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 观察指标

观察钩椎关节中椎体、椎间盘、骨髓核、骨小梁、骨组织及骨髓组织的形态及结构特点。

2 结果

2.1 苏木精—伊红染色结果

苏木精—伊红染色的钩椎关节侧纵切面上可见上下椎体及中间的椎间盘。周围结缔组织与椎体相通处可见不着色的钙盐沉积，中间可见骨髓核(软骨样基质)，上下椎体切面可见粉染骨小梁，骨小梁之间可见紫色骨髓组织(图1)。

2.2 甲苯胺蓝染色结果

甲苯胺蓝染色的钩椎关节中可以观察到成骨细胞和破骨细胞的各种骨组织形态。切片中可见椎体切面蓝染骨小梁，骨小梁体积、宽度及分布均正常(图1)。

a:骨小梁；b:骨髓组织；c:钙盐沉积；d:骨髓核；e:钩突(方框)

3 讨论

钩椎关节是成人颈椎的结构，具有独特性，其类似于“双莲桥关节”，最早由德国解剖学家Luschka在对成人颈椎的局部解剖过程中发现[11]。钩椎关节作为颈椎特有的结构，对头颅及寰枢椎生长发育、生物力学稳定、三维支撑与多向运动、颈髓保护和脊柱多维运动起着至关重要的限制和保护作用[12]。详细观察钩椎关节形态学结构有助于了解生长发育过程中钩椎关节基本组织变化及内部组织形成情况。

为研究钩椎关节组织形态学结构，本实验将苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色作为基本染色法，结合硬组织切片技术对钩椎关节形态学结构进行探讨。硬组织切片技术能够完整地保留骨组织原本的结构及成分，因此已成为目前最常用的观察骨组织的方式。其对于不脱钙的骨组织切片具有极佳的适配性，对研究骨组织成分以及骨形成有重要作用[13]，对于了解生长发育及组织构成具有极大意义。既往文献发现，苏木精—伊红染色可避免因为钙的存在而受影响的骨组织切片[14-16]。苏木精—伊红染色作为标准的染色方法，可将胞质内的核糖体及细胞核内的染色质染成紫蓝色，将细胞质染成红色[17-18]，该染色法通过阴阳离子互相结合，可起到加强固定效果[19]。在识别各种潜在的恶性病变中，甲苯胺蓝是一种实用且有效的辅助诊断工具[20-21]，其吩噻嗪类碱性染料的特征可将细胞核染成蓝色[22-23]。本研究在对钩椎关节的观察中采用苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色，在保留骨组织结构的情况下简化了实验步骤，又避免了脱钙失败对钩椎关节切片和染色的影响，两种染色方法相结合，可见钩椎关节骨小梁体积、宽度及分布均匀正常，骨髓组织分布于骨小梁之间，钙盐沉积在周围结缔组织与椎体相通处，上下椎体和椎间盘间隔鲜明。

在人体解剖结构中，钩椎关节及其毗邻结构对颈椎疾病的发生有着重要影响。Clausen等[24]对钩椎关节生物力学进行了有限元分析发现，钩椎关节的形成对下颈椎耦合运动起着重要作用，其可增加颈椎的活动度，而钩椎关节中钩突的形成却对颈椎活动有着限制力学载荷的影响。钩突的病变或增生可压迫和刺激周围的血管与神经，从而产生不同类型颈椎病的相关症状[25-26]；钩突也是骨关节炎发生的常见部位，关节表面因摩擦受损形成点蚀和磨痕，钩突变形成为骨赘刺，从而导致椎间孔狭窄[27-28]。钩突骨赘也可引起颈椎刺激或颈椎节段性不稳定[29-30]，骨赘的形成会压迫椎动脉及交感神经，对颈椎型心绞痛的发病机制产生一定的影响[31]。

钩椎关节作为最早退变的关节之一，不仅会导致成人疾病，在儿童生长发育过程中也起着重要作用。随着现代影像技术和相关研究手段的不断深入，普遍认为钩椎关节是根据颈椎发育的生物力学及随着年龄的增长、负重增加，颈椎钩突区域发生变化而形成的，即为反应性骨形成和退行性变的结果[32-33]。而儿童颈椎活动度有限，且颈椎负重较小，所以在儿童时期未形成钩椎关节[2]。故对钩椎关节的形成及影响等临床研究还有待深入。

综上，硬组织切片技术可以较完整地保留钩椎关节的固有组织形态，通过苏木精—伊红染色及甲苯胺蓝染色可清晰地观察成人钩椎关节的组织形态及各层结构。