半夏生物总碱对癫痫大鼠行为学、脑组织病理学及BDNF/Trk-B 表达的影响

邓楚欣，于征淼，林培政，吴智兵*

（1.广州中医药大学第一附属医院脑病中心脑病科，广州 510000；2.广州中医药大学温病教研室，广州 510000）

癫痫是一组病因及临床表现复杂的疾病，其标志性症状为自发痫性发作（spontaneous recurrent seizure，SRS）；随着癫痫病理机制（epileptogenesis）的发展，常合并行为、认知及精神方面的功能障碍。癫痫长期管理的发展目标涵盖3 个方面：控制痫性发作、改善癫痫合并症、抑制或逆转脑组织病损。现存的抗痫药（anti-epileptic drugs，AEDs）能有效控制痫性发作，但难以改善癫痫慢性病程[1-2]。半夏为天南星科多年生草本半夏的干燥块茎，在中医临床中常用于治疗以顽痰为本的痫病。半夏生物总碱（pinellia total alkaloids，PTA）可能是治疗癫痫的活性成分之一[3-4]。本研究用匹罗卡品（pilocarpine，PILO）建立大鼠癫痫模型[5]，以托吡酯为对照，评价半夏生物总碱对空间工作记忆能力、自主活动量、海马结构神经元的形态及数量、齿状回（dentate gyrus，DG）苔藓纤维发芽（Mossy fiber sprouting，MFS）现象以及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和络氨酸蛋白激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）蛋白表达量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF 级4～5 周龄雄性SD 大鼠92只，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF 级动物实验室 [SYXK（粤）2013-0092]，可自由取食，适应性饲养7 d 后体质量为（213.0 ± 12.03）g。半夏生物总碱（南京道斯夫，批号170325R）、托吡酯（大连美仑，批号F0601A）、PILO（Sigma-Aldrich，批号MKBW5175V）、氯化锂（LiCl）（Sigma-Aldrich，批号SLBP9949V）、甲基溴化东莨菪碱（methscopolamine bromide，MSB）（上海阿拉丁，批号E1529108）和水合氯醛（天津大茂，批号20160905）分别溶于生理盐水（normal saline，NS）（四川科伦，批号A17020606-1）。5%葡萄糖氯化钠注射液（glucose solution 加NS，GS 加NS）（四川科伦，批号A16070305-2）。

1.2 行为学测试 Y 臂迷宫用于强迫路线转换测试（forced alternation test，FAT）和自发路线转换测试（spontaneous alternation test，SAT），有3 条外观一致、互相呈120°的臂；旷场活动（open field locomotion，OFL）箱长90 cm、宽90 cm、高50 cm。适应性饲养结束后进行第1 次行为学测试，治疗结束后进行第2 次行为学测试。FAT 采集“目标臂停留时间”和“强迫路线转换行为（forced alternation behavior，FAB）”，计算FAB%=（组内正确选择目标臂的大鼠只数/组内大鼠只数）×100%；SAT 采集“自发路线转换行为（spontaneous alternation behavior，SAB）”，计算SAB%={SAB 次数/（总进入臂次数-2）}×100%；OFL 采集“进入格数”和“中心停留时间”[6-8]。

1.3 分组、造模、给药及取材 第1 次行为学测试后，92 只大鼠随机分为正常对照组18 只，模型组74 只。首先腹腔注射（intraperitoneal injection,ip）LiCl（127 mg/kg），17.5 h 后予MSB（1 mg/kg，ip）；再0.5 h后，模型组予PILO（30 mg/kg，ip），正常对照组予等量NS ip。首剂PILO 注射30 min 后如大鼠未进入癫痫持续状态（Status epilepticus，SE），追加1次PILO（10 mg/kg），最多追加4 次。SE 持续90 min 为造模成功，随后予7%水合氯醛（350 mg/kg，ip）终止发作，正常对照组在相应时点执行，水合氯醛注射20 min 后如发作仍未完全停止可追加1 次（87.5 mg/kg,ip）。自癫痫持续状态当天起，全部大鼠连续5 d 予GS 加NS（4 mL，ip）。按Racine 分级界定痫性发作级别，按Brandt 等的方案界定癫痫持续状态[9-10]。在癫痫持续状态后第6 天仍存活者再随机分为癫痫对照组（NS，n=13）、托吡酯组（0.06 g/kg，n=12）、PTA 低剂量组（0.4 g/kg，n=10）和PTA 高剂量组（0.8 g/kg，n=12）。以上4组与正常对照组（NS，n=17）每天灌胃1次，连续14 d。第2 次行为学测试后，一部分大鼠留取新鲜脑组织后置于液氮保存，一部分大鼠经4%多聚甲醛溶液（北京雷根，批号0313A17）行心脏灌流后留取固定脑组织。

1.4 病理染色 完成Nissl 染色（碧云天生物，批号042717170702）和Timm 染色（上海哈灵，批号20171124HL）后在显微镜（Olympus，型号IX3-RFACS）下拍照。Nissl 染色：在400 倍光镜下，在DG 颗粒细胞层、CA3 区和CA1 区分别选3 个连续视野拍摄，在齿状回门区（dentate hilus，DH）选2 个连续视野拍摄；用Image J 软件测量颗粒细胞层在视野中的面积占比；在CA3 区及CA1 区计数锥体细胞，在DH 计数多形细胞。Timm 染色：在400 倍光镜下的DG 颗粒细胞层及内侧分子层交界处选4 个连续视野拍摄；用Image J 软件将图像转换为8-bit，校正光密度后测量内侧分子层中MFS 的平均光密度。

1.5 Western-blot 法检测 在液氮中研磨新鲜海马结构组织后加入RIPA 裂解液（Thermo，批号SF249254），经离心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）后留取上清并行蛋白定量（Bio-world，BCA 定量试剂盒，批 号9802334）。取500 μL 样 品 混合125 μL loading buffer 后加热（70 ℃，10 min）。向每孔加样后用电泳仪（Bio-rad，型号1645052）跑胶：SDS-PAGE 浓缩胶（5%）恒压80 V-20 min，分离胶（15%，8%）120 V-1 h。转 膜：BDNF 用0.4A 恒 流 转45 min；Trk-B 用0.4A 恒流转1 h。取膜后用5%脱脂牛奶在常温封闭1 h 后，加入一抗在4 ℃孵育过夜，其中BDNF（1:1 000；北京博奥森，批号AH02263758）、Trk-B（1:5 000；上海艾博抗，批号GR308211-2）和β-actin（1:5 000；北京博奥森，批号AH01032107）。洗膜。随后用带有荧光素标记的二抗在常温下孵1 h，洗膜。将条带放到荧光成像系统（Odyssey Fc-LI-COR 显色仪）中显影及拍摄，用Image J 软件分析条带。

1.6 统计学方法 计量资料以均数±标准差（）表示，组内比较采用配对t检验；组间比较呈正态分布者进行单因素方差分析，方差齐时采用LSD 法，方差不齐时采用Games-Howell 检验；非正态分布者进行Kruskal-Wallis 检验。计数资料组间比较用χ2检验。

2 结果

2.1 半夏生物总碱对空间工作记忆能力及自主活动量的影响 见表1、表2。第2 次测试时，正常对照组FAB%为94.12%（16/17），与之比较，癫痫对照组（75%，9/12）、PTA 高剂量组（66.67%，8/12）、PTA 低剂量组（50%，5/10）和托吡酯组（50%，5/10）的FAB%较低（各P＜0.05）。

表1 PTA 对FAT-目标臂停留时间的影响（）

表1 PTA 对FAT-目标臂停留时间的影响（）

注：第1 次测试时PTA 低剂量组和第2 次测试时癫痫对照组分别剔除1 只大鼠。同一行，与第1 次测试比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 5 组大鼠第2 次行为学测试指标组间比较（）

表2 5 组大鼠第2 次行为学测试指标组间比较（）

注：同一列，与正常对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；与托吡酯组比较，△△P ＜0.01

2.2 半夏生物总碱对海马结构组织形态学病变的影响 见表3、图1。与正常对照组比较，癫痫对照组CA3 区、CA1 区及DH 的神经元数量显著减少，形态肿胀、排列紊乱，Nissl 小体减少；DG 见层状分布的、深染色的苔藓纤维发芽，在局部交织成片或深入内侧分子层。

图1 PTA 对海马结构组织形态学病变的影响（×400）

表3 PTA 对海马结构组织形态学病变的影响（）

表3 PTA 对海马结构组织形态学病变的影响（）

注：同一列，与正常对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；与癫痫对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与托吡酯组比较，▲▲▲P ＜0.001；与PTA 低剂量组比较，□□P ＜0.01

2.3 半夏生物总碱对海马结构BDNF 及Trk-B 蛋白表达量的影响 见表4、图2。

图2 PTA 对海马结构mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表达量的影响

表4 PTA 对海马结构mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表达量的影响（，n =5）

表4 PTA 对海马结构mBDNF、proBDNF 及Trk-B 蛋白表达量的影响（，n =5）

注：同一列，与正常对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 讨论

癫痫大鼠OFL“进入格数”显著增加反映过度活动，FAB%及SAB%显著降低反映空间工作记忆障碍，FAT“目标臂停留时间”缩短和OFL“中心停留时间”延长反映对陌生环境的适应能力下降。半夏生物总碱及托吡酯对过度活动的改善不显著，但半夏生物总碱0.4 g/kg 可在一定程度上提高SAB%、缩短“中心停留时间”，而半夏生物总碱 0.8 g/kg 可延长“目标臂停留时间”。典型的海马硬化表现为CA3 区、CA1 区和DH 的神经元减损，而DG 和CA2 区的神经元相对保留[11]。正常的苔藓纤维从DG 的颗粒细胞发出，连接DH的苔藓细胞和海马CA3区及CA1区的锥体细胞。在癫痫大脑中，DG 颗粒细胞的神经新生异常活跃，长出形态、分布及功能异常的苔藓纤维，形成异常投射环路，即所谓苔藓纤维发芽现象[12]。以上2 种病变易化痫性放电的产生及传递，并与癫痫合并症发病有关。半夏生物总碱 0.8 g/kg 对CA3 区及DH 的神经元减损存在显著的保护作用，而半夏生物总碱 0.4 g/kg及0.8 g/kg 和托吡酯均对苔藓纤维发芽存在显著的抑制作用。哺乳类动物的大脑中有两种BDNF 异构体，即proBDNF 及由其裂解而成的mBDNF。mBDNF 的受体为Trk-B，功能与神经元存活、突触可塑性和记忆功能有关。BDNF 和Trk-B 可通过以下机制加重癫痫病情：BDNF 结合Trk-B 后提高海马结构的兴奋性并促进DG神经新生；BDNF 增强谷氨酸能传导、下调K+-Cl-同向转运体功能、直接抑制γ-氨基丁酸受体介导的抑制性突触后电流，即弱化γ-氨基丁酸能系统功能[13-14]。半夏生物总碱及托吡酯显著降低mBDNF 的蛋白表达量，而半夏生物总碱对proBDNF 和Trk-B 的蛋白表达量也可能存在降低作用。

综上所述，半夏生物总碱对PILO 癫痫模型存在治疗作用，表现为改善空间工作记忆障碍、显著抑制海马硬化和苔藓纤维发芽现象及显著降低海马结构中mBDNF 的蛋白表达量；半夏生物总碱还可能降低海马结构中proBDNF 和Trk-B 的蛋白表达量。