白细胞介素-22及其受体在喉鳞状细胞癌中的表达及意义*

纪文君，王 鑫，张甜甜，周铭煜

（江苏省苏州高新区人民医院耳鼻咽喉头颈外科，苏州 215000）

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是最常见的头颈部肿瘤之一，每年发病率约占全球新发恶性肿瘤的2.4%[1-2]。尽管LSCC的诊断和治疗取得了进步，但在过去20年中患者的预后并未得到改善。尤其对中晚期LSCC 患者而言，即使进行了有效的外科手术切除，5年生存率仍较低。已经有众多的研究探讨LSCC的发病机制和转移途径，但目前LSCC的确切发病机制还不清楚。

有研究显示细胞因子、机体免疫应答和相关的炎性及免疫介质参与肿瘤的发病过程[3-4]。白细胞介素22（interleukin-22,IL-22）是近年来发现的IL-10 细胞因子家族中的一员,主要由固有淋巴细胞、Th17 细胞及Th22 细胞等分泌。IL-22 参与多种肿瘤的发病机制包括增殖和转移，如结肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、甲状腺癌和淋巴瘤等[5]。但是IL-22在LSCC发病中的作用尚未见相关报道，因此本研究通过检测LSCC 和癌旁组织中IL-22 及受体的表达，初步探讨IL-22 在LSCC 中与其预后的关系，从而为今后探讨LSCC 发病机制中是否有IL-22的参与，做出基础铺垫。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2013 年4—10 月哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科经过全喉切除或部分半喉切除术的LSCC 患者标本30 例，其中男25 例，女5 例，年龄43～76 岁。所有患者均为首次接受手术治疗，术前均未进行化疗、放疗以及其他生物治疗，且全身检查未发现存在肿瘤远处转移，全部手术切除标本经病理确诊为LSCC。选取LSCC组中23例全喉切除术的患者距离肿瘤＞2.0 cm以上的癌旁黏膜组织作为对照组，并经苏木精—伊红（HE）染色病理检查证实为喉正常组织。按照国际抗癌协会（UICC）TNM分类标准（2002）方案进行TNM分期，所有病例术后随访5 年，记录患者转移及死亡时间。本实验所有入选的LSCC组织和癌旁对照组织的标本均征得患者知情同意。

1.2 方法

手术切除后随即将符合标准的LSCC标本及其相应的癌旁组织分成两份，一份放入液氮中，转送至实验室-80 ℃冰箱保存。一份经4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋，然后再连续切取5 μm 厚度的石蜡切片待用。

1.2.1 HE 染色 石蜡切片经乙醇脱蜡，放入苏木精中染色5 min，自来水冲洗并充分浸泡5 min。伊红染液中2 min 然后常规脱水、透明、封片并烤干（HE 染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，中国）。在显微镜下观察喉癌组织和癌旁对照组织，证实所有喉癌组织切片为喉鳞状细胞癌，癌旁对照组织为无癌细胞正常组织。

1.2.2 免疫组织化学染色 石蜡切片在64 ℃烤箱脱蜡15 min，柠檬酸修复液置于微波炉中高火3 min煮沸，将石蜡切片放入修复液中，中火15 min，室温冷却。室温下3% H2O2湿盒中孵育10 min，PBS 缓冲液冲洗。滴加正常山羊血清封闭，加入相应浓度的一抗（Abcam，美国）（抗IL-22 抗体1∶300，抗IL-22R1抗体1∶300），放入4 ℃冰箱过夜16 h。PBS液清洗干净加入相应的兔抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国），放入保湿盒中，IL-22、IL-22R1 分别放入37 ℃烤箱中和静止于室温下30 min。DAB试剂盒显影，苏木精复染、脱水然后封片。

显微镜下观察黄色或棕黄色染色为阳性表达。每张切片随机观察10个高倍（×400）视野，每个高倍视野中计数100 个细胞，取其中阳性细胞数均数，计算百分比。判断标准[6-7]：将阳性肿瘤细胞所占的百分比评分，0 分为阴性，1 分为阳性细胞百分比≤10%，2 分为11%～50%，3 分为51%～75%，4 分为＞75%；染色强度评分，0 分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色。总免疫染色评分为强度评分乘以阳性细胞百分数评分，范围为0～12。将分数≤6定义为低表达，＞6定义为高表达。

1.2.3 实时荧光定量PCR 反应（RT-qPCR）将冰冻新鲜喉癌及癌旁对照组织标本，采用Trizol 试剂提取总RNA，紫外吸收测定法检测抽提RNA 纯度及浓度检测。按照PrimeScript RT reagent Kit 逆转录试剂盒说明书上的操作步骤进行逆转录反应并制备cDNA。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix 试剂盒说明书进行PCR 扩增反应。引物序列：IL-22，上游引物5’-GCAGGCTTGACAAGTCCAACT-3’，下游引物5’-GCCTCCTTAGCCAGCATGAA-3’；IL-22R1:上游引物5’-CTACATGTGCCGAGTGAAGA-3’，下游引物5’-ACATATCTGTAGCTCAGGTA-3’；β-actin：上游引物5’-GCAAGCAGGAGTATGACGAG-3’，下游引物5’-CAAATAAAGCCATGCCAATC-3’。每个标本设3 个复孔，取其CT 平均值，以β-actin 作为管家基因，采用2-△△Ct计算目的基因在LSCC及癌旁组织的差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计数资料采用频数或百分率（%）表示，率的比较采用χ2检验和Fisher 确切概率法。Kaplan—Meier 生存曲线分析LSCC 中IL-22 及IL-22R1 表达与患者总体生存期的关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-22及IL-22R1在LSCC中的表达

IL-22阳性染色主要分布在细胞质，很少在细胞核中表达。在LSCC 组中IL-22 主要表达在肿瘤细胞及癌巢周围的间质或纤维组织中。在癌旁对照组织中IL-22阳性表达主要位于鳞状上皮细胞和炎性细胞，尤其在CD4+T 细胞和巨噬细胞中表达（图1）。IL-22在LSCC 中的表达明显高于在对照组中的表达（P＜0.05）（图2）。

IL-22R1也主要在细胞质中表达，在LSCC组中主要表达在肿瘤细胞。在对照组织中，IL-22R1 的表达主要分布在上皮细胞、间质、黏膜下腺体、血管上皮细胞和炎性细胞（图1）。而且IL-22R1在LSCC组中的表达明显高于对照组（P＜0.05）（图2）。

图2 IL-22及IL-22R1在LSCC组及对照组表达的比较

2.2 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 在LSCC 中的表达

IL-22 mRNA 及其IL-22R1 mRNA 在LSCC 组中明显高于对照组（P＜0.05），见图3。

2.3 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 表达与LSCC 临床病理特征之间的关系

IL-22 mRNA 及IL22R1 mRNA 的表达与LSCC的临床分期和区域淋巴结转移明显相关（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、原发部位无关、T 分期和病理分化程度无明显差异（均P＞0.05），见表1。

表1 IL-22 mRNA 和IL-22R1 mRNA 表达与喉癌临床病理特征的关系 n

2.4 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 表达与LSCC 患者生存分析

高表达IL-22 mRNA的LSCC 患者平均生存期（39个月）明显短于低表达IL-22 mRNA的LSCC 患者平均生存期（P＜0.05），见图4。生存曲线同时也显示高表达IL-22R1 mRNA的LSCC患者平均生存期（80 个月）明显短于低表达IL-22R1 mRNA 的LSCC患者平均生存期（P＜0.05），见图5。

图4 IL-22 的表达与生存曲线的关系

图5 IL-22R1 mRNA 的表达与生存曲线的关系

3 讨论

LSCC是仅次于口腔癌的头颈部常见的第二大恶性肿瘤，也是呼吸系统常见的第二大肿瘤[8]。LSCC 的主要病理类型为鳞状细胞癌，约占总数的96%～98%。LSCC可发生于喉内所有区域，以声门区癌最为多见，其次为声门上区，以声门下区极少见。在我国北方地区发病率明显高于南方地区，男性患者明显多于女性患者。LSCC的发病原因十分复杂，至今仍不十分明确。

研究显示在头颈部鳞状细胞癌基质中，LSCC是一种与周围肿瘤微环境具有广泛相互作用的实体肿瘤[9-10]。肿瘤周围的基质和细胞浸润构成了肿瘤的微环境。先天免疫系统和适应性免疫细胞以及其他细胞因子和信号分子参与了肿瘤微环境的形成[11]。例如，肿瘤坏死因子超家族成员13（tumor necrosis factor superfamily member 13）[9]、IL-33[8]、高水平的CXCL5[7]等多种细胞因子直接或者间接的导致喉癌细胞的发生和发展。

2000 年Dumoutier 等[12]用IL-9 刺激小鼠T 淋巴细胞发现了一种新型细胞因子，编码一种α 螺旋状的蛋白质，由于其主要结构与IL-10 极其相似具有抗炎和免疫调节作用，将其命名为IL-10相关的T细胞衍生诱导因子（iL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF）。随后，由Xie 等[13]将其命名为IL-22，并将其归属于IL-10 家族中。IL-22 主要由Th22、Th1、Th17细胞、固有淋巴细胞（ILCs）、γδT细胞和NKT 细胞表达[13-14]。IL-22 受体为IL-22R1 和IL-10R2，其中IL-22R1是IL-22的特异性结合受体，主要作用于表达IL-22R1 的上皮细胞。IL-22 与表达IL-22R1的细胞结合而发挥生物学作用。

既往研究发现IL-22具有上调抗凋亡通路及促进细胞增殖的作用，因此，在一些急性炎症或组织损伤的情况下，IL-22 主要起保护作用。在增殖及抗凋亡为促进因素的疾病中，IL-22也起着促进疾病发展的作用。Kobold等[15]的研究表明，IL-22可增加肺癌细胞株的耐药性，Zhuang 等[16]发现IL-22＋CD4＋T 细胞及Th22 细胞是构成胃癌肿瘤微环境的重要成分、增加瘤内的IL-22＋CD4＋T细胞及Th22细胞可促进胃癌的发展且与胃癌患者的预后相关等研究相一致，IL-22 能够通过活化某些致癌转录因子，从而激活某种或几种信号通路（如STAT3 信号传导通路[17-18]）促进癌症细胞的增殖，抑制细胞凋亡，促进肿瘤的远处转移。

本次IL-22 及IL-22R1 在LSCC 中的研究中，免疫组织化学实验结果显示IL-22 及IL-22R1 不仅在癌巢集中区表达丰富，还在癌巢间质中散在分布。IL-22及IL-22R1在LSCC中的表达显著高于癌旁对照组织。同时RT-qPCR 结果显示LSCC 组IL-22 及IL-22R1 mRNA 表达明显高于对照组，提示IL22 及IL-22R1 高表达与LSCC 的发病密切相关。通过分析与LSCC患者临床病理特征的关系，我们发现IL-22及IL-22R1的表达与LSCC淋巴结转移和临床分期有关。IL-22 及IL-22R1 在临床Ⅲ/Ⅳ期中的表达明显高于临床Ⅰ/Ⅱ期，在淋巴结转移组中明显高于无淋巴结转移组。通过LSCC 患者5 年随访生存期，结果显示IL-22 及IL-22R1 高表达患者预后较差，生存期明显缩短。表明，IL-22 及IL-22R1 在LSCC 组织中表达增高，并且与淋巴结转移和预后密切相关，其可能是LSCC的重要生物标志物。

综上，IL-22 及IL-22R1 在LSCC 组织中表达增高，并且与淋巴结转移和预后密切相关。肿瘤微环境中免疫细胞介导的宿主反应对肿瘤的发生有重要作用。识别细胞因子作为恶性转化的生物标志物，有助于指导诊断和靶向治疗。IL-22在LSCC发病中的具体机制还需要进一步的研究，IL-22可能是LSCC 治疗的新靶点，为LSCC 的治疗提供新的途径。