FoxO1在同型半胱氨酸诱导的肾脏足细胞损伤及凋亡中的作用研究

张宏红，谢琳，盛思琪，卢冠军，姜怡邓，杨安宁，李桂忠△

临床上由代谢性疾病引起的肾损伤较为常见。同型半胱氨酸（Hcy）系含巯基的氨基酸，参与甲硫氨酸循环［1］。研究发现Hcy可损伤血管内皮细胞，影响其修复功能，进而导致血管内皮脂质代谢紊乱［2］。Hcy代谢异常可诱导肾功能受损，导致血肌酐升高，出现蛋白尿［3］。足细胞位于肾小囊的最内层，可高度特化并最终形成肾小球的脏层上皮细胞，进而构成肾单位滤过膜的外层，维持滤过屏障的正常功能［4］。足细胞结构或功能异常（如足细胞融合、足细胞间隔损伤等）被认为是肾功能损伤的关键因素［5］。此外，细胞凋亡是足细胞受损的形式之一［6］。叉头状转录因子（FoxO）蛋白家族在调节细胞新陈代谢和调控细胞周期等方面具有重要作用，其中FoxO1是研究最广泛的亚型［7］。FoxO1可以通过调控细胞凋亡参与多种疾病的发生发展［8］。然而，FoxO1在肾损伤和足细胞凋亡中的作用机制尚不明了。本文旨在探讨FoxO1在Hcy诱导的足细胞损伤和凋亡中的作用，为研究Hcy在肾脏损伤中的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 小鼠肾小球足细胞（MPC-5）购自上海瑞鹿生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；Hcy购自美国Sigma公司；胰蛋白酶消化液购自上海碧云天公司；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司；实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒、反转录试剂盒购自日本Takara公司；总RNA提取试剂盒购自北京天根公司；兔源足细胞裂隙膜蛋白（Podocin和Nephrin）、FoxO1、半胱氨酸蛋白酶12（Caspase12）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）一抗均购自英国Abcam公司，鼠源内参蛋白β-actin一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司；PAS染色试剂盒、苏木素染液购自北京Solarbio公司；FoxO1和GAPDH引物由上海生工公司合成；qPCR仪购自德国耶拿公司；电泳仪、电转仪、凝胶成像仪均购自美国Bio-Rad公司；CO2培养箱购自德国Heraeus公司。

1.2实验动物和分组 4周龄，体质量18～22 g的胱硫醚β-合成酶（Cbs）基因正常Cbs+/+小鼠（Cbs+/+组）和单基因敲除Cbs+/-小鼠（Cbs+/-组）各10只，购自美国Jackson实验室［实验动物合格证号：SCXK（京）2016-0006］，于宁夏医科大学实验动物中心饲养。20只小鼠均在湿度为60%左右，温度（25±2）℃，光照与黑暗各12 h交替的SPF级环境内分笼饲养，以2%高蛋氨酸饮食喂养8周后进行后续实验。

1.3PAS染色检测肾小球形态学变化 喂养8周后处死小鼠，取肾脏组织，石蜡包埋切片后脱蜡、脱水，蒸馏水洗2min；滴加过碘酸溶液，氧化5 min；自来水洗3次，每次5 min；滴加Schiff试剂，浸染10～20 min；弃去Schiff试剂，自来水冲洗3次，每次5 min；滴加苏木素染色液，染核1～2 min；自来水冲洗3次，每次5 min；酸性乙醇分化液分化；Scott反蓝液洗3 min；常规透明、封片，显微镜下观察切片。

1.4细胞培养和分组 在37℃、5%CO2的培养箱中以DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）培养肾小球足细胞。当细胞密度达到80%～90%时用胰蛋白酶消化进行传代，传至第3代时取对数生长期细胞进行实验并分为Control组（仅更换培养液）和Hcy组（用含80μmol∕L Hcy的细胞培养液干预48 h）。

1.5细胞转染及分组 将携带绿色荧光蛋白（GFP）的过表达FoxO1腺病毒（Ad-FoxO1）和干扰FoxO1腺病毒（Sh-FoxO1）分别转入生长状态良好的肾小球足细胞中，分为对照组（仅更换培养液）、Ad-GFP组（过表达对照组）、Ad-FoxO1组（过表达FoxO1组）、Sh-NC组（干扰对照组）、Sh-FoxO1组（干扰FoxO1组）、Ad-GFP+Hcy组、Ad-FoxO1+Hcy组、Sh-NC+Hcy组、Sh-FoxO1+Hcy组。转染6 h后更换液体，24 h后在荧光倒置显微镜下检测各组细胞荧光强度，验证转染效率，转染成功后用于后续实验。

1.6Western blot检测Podocin、Nephrin、FoxO1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase12蛋白表达 收集各组细胞，提取总蛋白，BCA蛋白定量后煮沸变性。每组取30μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后以0.3 A恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。分别加入兔源Bax、FoxO1、Bcl-2、Podocin、Caspase12、Nephrin一抗以及鼠源β-actin一抗（稀释比均为1∶1 000），4℃孵育12 h；使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min；ECL化学发光试剂显影曝光。应用Image Lab软件对检测结果的灰度值进行分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

1.7qPCR检测小鼠肾组织和足细胞中FoxO1 mRNA的表达 提取肾脏组织和足细胞总RNA，反转录为cDNA，采用qPCR扩增FoxO1及GAPDH。反应体系为20μL，扩增程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，70℃10 s，共40个循环，以GADPH为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.8统计学方法 采用Graph Pad Prism 7.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肾小球损伤情况 PAS染色观察小鼠肾小球形态变化，可见Cbs+/+组小鼠肾小球结构正常，基底膜清晰且分布均匀，而Cbs+/-组小鼠肾小球基底膜呈现节段性增厚，系膜基质增多。见图1。

Fig.1 Representative PAS staining results of each mouse group(×400)图1 PAS染色观察小鼠肾小球损伤情况（×400）

2.2 小鼠肾组织中Podocin、Nephrin和FoxO1的表达水平 Western blot结果显示，与Cbs+/+组小鼠相比，Cbs+/-组小鼠肾组织中Podocin蛋白（0.72±0.11vs.1.23±0.07，t=9.787，n=6）和Nephrin蛋白（0.54±0.08vs.1.14±0.16，t=8.259，n=6）表达水平均显著降低（P＜0.01）；qPCR和Western blot结果显示，与Cbs+/+组相比，Cbs+/-组 小 鼠 肾 组 织 中FoxO1 mRNA（1.75±0.20vs.2.69±0.50，t=4.304，n=6）和FoxO1蛋白（0.38±0.09vs.0.94±0.20，t=6.289，n=6）表达水平显著降低（P＜0.01），见图2。

Fig.2 The protein expression levels of Podocin，Nephrin and FoxO1 in the kidney tissues of each mouse group图2 Western blot检测各组小鼠肾组织中Podocin、Nephrin和FoxO1的蛋白表达水平

2.3 Hcy对足细胞中FoxO1表达的影响 qPCR和Western blot结果显示，与Control组比较，Hcy组FoxO1 mRNA（0.18±0.08vs.0.83±0.04，t=12.810，n=3）和FoxO1蛋白（0.40±0.02vs.0.78±0.04，t=14.450，n=3）表达水平均显著降低（P＜0.01），见图3。

Fig.3 The effect of Hcy on FoxO1 protein expression in podocytes detected by Western blot assay图3 Western blot检测Hcy对足细胞中FoxO1蛋白表达的影响

2.4 过表达和干扰FoxO1后足细胞中FoxO1表达情况 Western blot结果显示，对照组、Ad-GFP组、Ad-FoxO1组FoxO1蛋白表达量分别为0.14±0.04、0.13±0.01和1.09±0.16，与Ad-GFP组相比，Ad-FoxO1组FoxO1蛋白表达水平显著增加（F=105.200，n=3，P＜0.01），见图4。对照组、Sh-NC组和Sh-FoxO1组FoxO1蛋白表达量分别为0.87±0.12、0.83±0.09和0.35±0.02，与Sh-NC组相比，Sh-FoxO1组FoxO1蛋白表达水平显著减少（F=35.210，n=3，P＜0.01），见图5。

2.5 过表达FoxO1对足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，与Ad-GFP+Hcy组相比，Ad-FoxO1+Hcy组中Podocin和Nephrin蛋白表达均明显升高，Bax∕Bcl-2比值、Caspase12蛋白表达均明显降低（P＜0.05），见图6、表2。

Fig.4 The protein expression levels of FoxO1 in podocytes after overexpressed FoxO1 detected by Western blot assay图4 Western blot检测过表达FoxO1后足细胞中FoxO1表达情况

Fig.5 The protein expression levels of FoxO1 in podocytes after restrained FoxO1 detected by Western blot assay图5 Western blot检测抑制FoxO1后足细胞中FoxO1表达情况

Fig.6 The effect of overexpressed FoxO1 on the protein expression levels of Podocin，Nephrin and apoptosis-related protein in podocytes detected by Western blot assay图6 Western blot检测过表达FoxO1对足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白表达的影响

Tab.2 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression in podocytes after overexpressed FoxO1 in the four groups表2 过表达FoxO1后各组足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白的表达变化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression in podocytes after overexpressed FoxO1 in the four groups表2 过表达FoxO1后各组足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白的表达变化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与Hcy组比较，c与Ad-GFP+Hcy组比较，P＜0.05。

组别对照组Hcy组Ad-GFP+Hcy组Ad-FoxO1+Hcy组F Podocin 1.32±0.11 0.73±0.08a 0.72±0.04a 1.31±0.07bc 55.220＊＊Nephrin 0.58±0.08 0.36±0.01a 0.30±0.08a 0.61±0.04bc 20.110＊＊Bax∕Bcl-2 0.52±0.04 1.17±0.16a 0.91±0.11a 0.36±0.06bc 38.990＊＊Caspase12 0.55±0.05 0.92±0.14a 0.84±0.05a 0.28±0.04abc 39.580＊＊

2.6 干扰FoxO1对足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，与Sh-NC+Hcy组相比，Sh-FoxO1+Hcy组中Podocin和Nephrin蛋白表达均明显降低，Bax∕Bcl-2比值、Caspase12蛋白表达均明显增高（P＜0.05），见图7、表3。

Tab.3 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression after FoxO1 interference in the four groups of podocytes表3 干扰FoxO1后各组足细胞中Podocin、Nephrin及凋亡相关蛋白的表达变化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与Hcy组比较，c与Sh-NC+Hcy组比较，P＜0.05。

组别对照组Hcy组Sh-NC+Hcy组Sh-FoxO1+Hcy组F Podocin 0.76±0.04 0.49±0.08a 0.54±0.05a 0.23±0.01abc 55.060＊＊Nephrin 0.89±0.08 0.56±0.04a 0.60±0.02a 0.30±0.01abc 80.500＊＊Bax∕Bcl-2 0.30±0.04 1.33±0.21a 1.47±0.23a 2.52±0.28abc 54.480＊＊Caspase12 0.26±0.03 0.64±0.09a 0.60±0.06a 0.95±0.03abc 65.120＊＊

3 讨论

Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物，其代谢异常引发的高同型半胱氨酸血症（HHcy）已被证明是心脑血管疾病、慢性肾损伤、神经退行性疾病、甲状腺功能减退、恶性肿瘤等多种疾病的独立危险因素［9-11］。研究发现肾脏在Hcy代谢方面发挥着重要作用，HHcy是慢性肾脏病或急性肾损伤发生的常见原因［12］，但对Hcy参与肾脏损伤的分子机制研究甚少。本课题组前期研究已证明，当小鼠体内Cbs基因缺陷时血清Hcy水平明显增高［13］。本研究通过PAS染色检测小鼠肾小球形态学变化，发现Cbs+/+小鼠肾小球结构正常，基底膜清晰且分布均匀，而Cbs+/-小鼠肾小球基底膜呈现节段性增厚，系膜基质增多，提示小鼠血清Hcy水平升高导致肾小球结构发生异常改变。足细胞是肾单位滤过膜的关键成分［4］。足细胞受损是许多肾脏疾病发生发展的共同过程，如糖尿病肾病［14］、HHcy相关肾病［15］和高血压性肾病［16］等。足细胞裂隙膜蛋白Nephrin属于跨膜蛋白，其与Podocin蛋白结合后与细胞骨架中的肌动蛋白连接，构成滤过物质的最后一道防线，即滤过隙膜。Podocin和Nephrin表达下降可导致蛋白尿的发生，是反映足细胞损伤程度的重要指标［17］。本研究发现，Cbs+/-组与Cbs+/+组小鼠相比Podocin和Nephrin蛋白表达水平明显降低，提示Hcy水平升高可以导致Cbs+/-小鼠肾脏足细胞损伤。

FoxO1属于FoxO蛋白家族，目前对于FoxO1的研究较为深入，其在许多疾病的发生发展中具有重要影响，包括肝脏脂肪变性、白血病和糖尿病等［18］。此外，FoxO1还参与足细胞和系膜细胞增殖、氧化应激、细胞外基质积累和上皮-间充质转分化的调节［19-21］，且FoxO1作为一种转录因子，具有调控细胞增殖和凋亡的作用［22］，但其在Hcy诱导的足细胞凋亡中的作用尚未明确。研究发现，硫化氢供体GYY4137和（或）FoxO1抑制剂AS1842856可通过调节Akt∕FoxO1通路减轻HHcy诱导的系膜细胞损伤和细胞外基质重塑［23］。本研究发现，Cbs+/-小鼠肾组织和Hcy干预后足细胞中FoxO1的表达水平均明显降低，提示FoxO1可能参与Hcy致Cbs+/-小鼠肾小球足细胞损伤的过程。为了进一步明确FoxO1在Hcy诱导的足细胞损伤中的作用，本研究在过表达和干扰FoxO1后，检测Podocin和Nephrin表达，发现过表达FoxO1明显促进Podocin和Nephrin的表达，而干扰FoxO1后Podocin和Nephrin蛋白表达则明显下降，进一步提示FoxO1参与了Hcy致小鼠肾小球足细胞损伤的过程。

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程，可参与多种疾病的发生发展，而足细胞凋亡会损害肾单位滤过膜的正常结构和功能，并最终导致肾损伤［24］。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在凋亡中发挥关键作用，当凋亡增加时，其Bax∕Bcl-2比值升高，反之则降低［25］。Caspase12为一类半胱氨酸蛋白酶，具有调节细胞生长、分化的作用，并参与细胞凋亡，Caspase12的出现标志着凋亡过程进入不可逆阶段［26］。本研究用Hcy干预足细胞后，分别转染过表达和干扰FoxO1腺病毒检测Bax、Bcl-2和Caspase12蛋白表达水平，发现过表达FoxO1明显减轻足细胞凋亡，而干扰FoxO1则明显促进细胞凋亡，表明FoxO1可以减少Hcy引起的足细胞凋亡。以上结果表明FoxO1可以明显缓解Hcy引起的足细胞凋亡。

综上所述，Hcy可诱导肾脏足细胞损伤，FoxO1可减轻Hcy所致的足细胞损伤，并减少足细胞的凋亡，本研究为HHcy相关肾病的防治提供了新的依据。