DNMT3B、MMP-2和ENA-78在子宫内膜异位组织中表达及相关性

林 丹 楼江燕

四川大学华西第二医院，四川大学出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室(成都， 610041)

子宫内膜异位症女性中21%～47%合并不孕症，71%～87%并发慢性盆腔疼痛[1]。子宫内膜异位症发病机制极具争议，当前认为包括经血逆流种植理论、体腔化生理论、良性转移、淋巴和静脉传播理论、机体免疫异常、遗传学原因等[1-3]。DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)在子宫内膜异位症中异常表达促使某些基因异常甲基化，使相关基因和蛋白表达异常，从而导致子宫内膜异位病变的产生和进展[4]。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)主要通过调节细胞外基质的更新过程参与多种病理生理过程，还能调节细胞间黏附和血管生成，在子宫内膜异位症中的作用不容小觑[3]。上皮来源中性粒细胞活化肽(ENA-78)是重要的血管形成因子，在子宫内膜异位症发生发展过程中意义不凡[5]。本文主要探究DNMT3B、MMP-2和ENA-78在子宫内膜异位症的表达及相关性，为相关研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月—2020年10月本院就医的子宫内膜异位症患者51例(异位症组)。纳入标准：临床确诊子宫内膜异位症；既往未因子宫内膜异位症接受过药物治疗；依从性良好，可以配合完成检查项目。排除标准：合并其它良性或严重疾病；合并恶性肿瘤；近3个月内接受过任何治疗。选择同期在本院行绝育手术的月经周期正常健康女性37例作为对照组，排除近期患有其它疾病及近3个月内接受任何药物治疗者。本研究获本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 取材及样本处理

异位症组行腹腔镜手术时采集异位内膜组织和在位内膜组织样本，对照组在行绝育手术时采集子宫内膜组织样本。所有样本采集后立即用10%中性福尔马林固定，经脱水处理后石蜡包埋制成组织蜡块，连续切片。每份组织样本各取一张切片进行苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察，以观察到典型子宫内膜组织作为样本合格标准。

1.3 检测方法

样本DNMT3B、MMP-2、ENA-78表达采用基于链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)的免疫组化染色检测。检测用鼠抗人DNMT3B单克隆抗体、鼠抗人ENA-78单克隆抗体均为英国Abbexa公司产品，鼠抗人MMP-2单克隆抗体、SP免疫组化染色试剂盒、山羊血清、DAB显色试剂盒均为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。工作浓度DNMT3B一抗为1:200，MMP-2一抗为1:100，ENA-78一抗工作浓度为1:150。阴性对照使用PBS替代一抗，阳性对照使用已知阳性样本。

1.4 结果判断

DNMT3B、MMP-2、ENA-78免疫组化阳性着色主要定位在细胞浆，呈棕黄色。每张样本切片随机选择高倍镜(×400)下至少5个视野观察组织染色情况，结果判定参考文献[6]，即统计阳性着色细胞检出率和细胞着色强度并分别计分，阳性着色细胞检出率计分：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；细胞着色强度计分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分；阳性程度判断标准：(阳性着色细胞检出率计分+细胞着色强度计分)/2，<0.5分为阴性(-)，0.5～<1.5分为弱阳性(+)，1.5～2.5分为中阳性(++)，>2.5分为强阳性(+++)。由2位病理医生分别独自完成免疫组化结果判读，判读结果不同时共同商讨确定最终结果。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 组织中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表达

异位症组年龄(33.1±7.1)岁(23～46岁)，对照组年龄(33.4±4.8)岁(25～42岁)，两组年龄构成无差异(t=0.230，P=0.818)。DNMT3B、MMP-2、ENA-78在不同子宫内膜组织中表达的免疫组化见图1(2014页)。异位内膜中DNMT3B、MMP-2、ENA-78的表达阳性率均高于在位内膜和对照组子宫内膜(P<0.05)，而在位内膜和对照组子宫内膜无差异(P>0.05)。见表1。

表1 不同子宫内膜组织中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表达比较(例)

2.2 异位内膜中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表达相关性

Spearman相关性分析显示，在异位内膜中DNMT3B、MMP-2表达呈正相关(r=0.426，P=0.002)，MMP-2、ENA-78表达呈正相关(r=0.289，P=0.040)，DNMT3B、ENA-78表达无相关性(r=0.097，P=0.499)。

2.3 DNMT3B、MMP-2、ENA-78诊断子宫内膜异位

以DNMT3B、MMP-2、ENA-78分别在异位症组异位内膜和对照组子宫内膜中的表达情况进行ROC曲线分析，结果见表2。DNMT3B、MMP-2、ENA-78联合检测的AUC(0.924) 高于DNMT3B、ENA-78检测(Z=2.077、2.717，P<0.05)，但与MMP-2检测相差不大(Z=1.731，P=0.08)。DNMT3B、MMP-2、ENA-78联合检测的准确度高于各单指标检测(Z=3.048、2.885、3.364，P<0.01)。

表2 各检测指标诊断子宫内膜异位症效能

3 讨论

子宫内膜异位症发病机制复杂，病情多变，复发可能性高，为临床诊疗带来了严峻挑战。目前普遍认为，子宫内膜异位症是一种表观遗传学病症，其产生、发展与DNA甲基化息息相关[4]。DNMT3B作为DNA甲基化的关键酶，近几年成为子宫内膜异位症疾病发生机理研究指标。Wu等[7]研究表明，DNMT3B mRNA在子宫内膜异位症内膜表达高于在位内膜和对照正常内膜。胡启彩等[8]与李德奎等[9]研究报道，与非子宫内膜异位症对比，子宫内膜异位症患者DNMT3B表达水平升高。本次研究发现，DNMT3B在异位症组异位内膜中的表达阳性率高于在位内膜和对照组子宫内膜，提示DNMT3B在内膜中过表达可能提高了DNA甲基化水平，造成某些基因和蛋白的异常表达，从而促进内膜异位生长，促进病灶的形成和进展。但与本次研究结果不符的是，王礼贤等[10]研究认为，DNMT3B mRNA在子宫内膜异位症患者的在位内膜、异位内膜中的表达水平均低于对照组子宫内膜。推测原因可能在于受试人群、样本及样本量等差别。

子宫内膜异位症虽是良性病，但却具有包括局部浸润性生长、远处种植迁移、新生血管生成等在内的恶性特质[1-3]。MMPs是一种重要的细胞外基质转换酶，与子宫内膜异位症的恶性特质有关[11-12]。在异位病变子宫内膜和(或)在位子宫内膜中活跃的MMPs可导致细胞外基质自毁，进而促进子宫内膜上皮细胞向更深组织层侵袭，这是子宫内膜异位病变局部形成和扩散的必要过程[12]。MMP-2作为MMPs家族中的主要成员，成为子宫内膜异位症疾病发生机理研究的热门指标。Sui等[3]研究发现，MMP-2在子宫内膜异位症患者血清、腹膜液和子宫内膜中表达水平均高于非子宫内膜异位症对照组；Cazacu等[11]报道，MMP-2在子宫内膜异位病变中的表达水平高于在位内膜；Nanda等[13]也认为，与非子宫内膜异位症对照组相比，子宫内膜异位症的MMP-2表达显著增加。本次研究，MMP-2在异位症组异位内膜中的表达阳性率高于在位内膜和对照组子宫内膜，提示MMP-2在内膜中过表达，导致子宫内膜细胞外基质过分降解，助长异位内膜的侵袭、粘附和种植能力，致使生成新血管，从而促成内膜异位生长，造成病情进一步发展。

子宫内膜异位症属慢性炎症，特征是全身和局部某些促炎细胞因子和生子因子增加、免疫失调[1-2]。ENA-78作为重要的炎症相关趋化性细胞因子和血管生成因子，成为子宫内膜异位症研究重点。金莉等[14]研究报道，ENA-78在子宫内膜异位症患者中高表达；顾华芬等[15]研究发现，子宫内膜异位症患者血清ENA-78水平高于子宫内膜在位的良性肿瘤患者和健康女性；刘洋等[5]研究发现，与正常健康人群对比，子宫内膜异位症患者血清ENA-78含量增加。本次研究，异位症组异位内膜中ENA-78表达阳性率高于在位内膜和对照组子宫内膜，提示ENA-78在异位内膜中过表达，可导致组织局部缺氧缺血，造成类似炎症的纤维化，加重盆腔粘连；还可促进新血管的产生，从而参与子宫内膜异位症发生。

本研究分析显示，异位内膜中DNMT3B与MMP-2的表达正相关，推测异位内膜中DNMT3B的表达可能通过改变DNA甲基化状态来改变异位内膜中MMP-2表达；异位内膜中MMP-2的表达也可能通过某种途径来影响异位内膜中DNMT3B表达，二者协同作用促进子宫内膜异位症的产生和进展；异位内膜中MMP-2与ENA-78的表达正相关，推测异位内膜中MMP-2和ENA-78的表达可能通过某种途径相互影响，共同促成异位内膜血管的形成，在子宫内膜异位症的产生和进展中起协同作用。本次研究分析，DNMT3B、MMP-2、ENA-78联合检测诊断子宫内膜异位症的价值较高，诊断准确度高于单项指标检测。

综上所述，DNMT3B、MMP-2、ENA-78在异位内膜中的阳性率显著增加，可能3者协同参与了疾病的发生发展；3项指标联合检测诊断子宫内膜异位症具有较好的准确性，有望作为疾病诊断、监测及预后的可靠指标；在子宫内膜异位症中的相互作用机制及其诊治价值仍有待进一步研究。