基于分光光度法快速检测果蔬中的拟除虫菊酯类农药残留

◎ 何丽媛，倪树标，武悦俊，张红刚

（广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省食品营养与安全快速检测仪器工程技术研究中心，广东 广州 510070）

我国是一个农业生产大国，蔬菜水果产量大，但生产方式主要以农户分散种植为主，往往存在盲目使用、过量使用、不按安全间隔期使用农药等不规范情况，从而造成了蔬菜水果中的农药残留问题[1]。调查表明，检出率较高的农药主要为拟除虫菊酯类、有机磷类和氨基甲酸酯类农药[2-4]。由于蔬菜水果的产量大、生产分散、销售期短，且专业技术强、成本高、检测时间长，实验室检测技术根本无法满足蔬菜水果的全面监测，因此农药残留快速检测技术是我国食品安全监管的主要技术手段。而拟除虫菊酯类农药已成为第二大类除虫剂，其使用量约占所有农药使用量的1/4[5]，且其对哺乳动物具有神经毒性，对生殖系统、心血管系统、免疫系统也都有毒害作用[6-8]。因此研究拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法，对进一步实施食用农产品的全面监测具有重要意义。

酶抑制法是根据农药对酶的抑制作用来测定农药的残留量，农药残留量越大，产生的抑制作用越强，酶水解底物的能力越弱。李玉兰[9]研究发现多种拟除虫菊酯类农药对特定羧酸酯酶均具有明显抑制作用。羧酸酯酶（Carboxlesterase，CaEs，EC3.1.1.1）属于α/β折叠水解酶家族，在水存在的条件下能够水解代谢带羧基的酯[10]。它在哺乳动物体内分布广泛，主要存在于肝脏和血清中。羧酸酯酶对α-乙酸萘酯具有较高的水解活性，其水解产物α-萘酚与显色剂固蓝B盐偶氮化反应生成红色物质，反应式如图1所示[11]。

图1 羧酸酯酶对α-乙酸萘酯的水解及显色反应式图

本文选用猪肝羧酸酯酶作为工作酶，α-乙酸萘酯为反应底物，固蓝B盐为显色剂，十二烷基硫酸钠（SDS）为终止剂，加入拟除虫菊酯类农药残留抑制猪肝羧酸酯酶，利用分光光度法测定酶的活性变化，利用拟除虫菊酯类农药对猪肝羧酸酯酶的抑制效果，从而快速检测果蔬中的拟除虫菊酯类农药残留。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

猪肝羧酸酯酶（3.5 KU），SIGMA-ALDRICH；α-乙酸萘酯（≥98%）、固蓝B盐、α-萘酚，北京伊诺凯科技有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，西亚试剂；联苯菊酯标准品（≥99.3%），广州佳途科技股份有限公司；甲氰菊酯标准品（≥99%），中国计量科学研究院；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、浓盐酸（12 mol·L-1）、无水乙醇，广州化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（岛津UV-2450），岛津；多功能食品安全检测仪（GC-600E），中国广州分析测试中心；万分位天平（BSM220.4），上海卓精电子科技有限公司；pH计（雷磁PHS-3G），上海仪电科学仪器；电热恒温水浴锅，北京精科华瑞仪器有限公司；涡旋混匀器（XK80-A），江苏新康医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制

（1）PBS（pH=6.5）。分别称取11.9 g无水磷酸氢二钠和3.2 g磷酸二氢钠，加入蒸馏水溶解定容至1 000 mL，使用pH计缓慢加入6 mol·L-1盐酸调节pH=6.5。

（2）酶液。称取10 mg猪肝羧酸酯酶，PBS溶解并定容至10 mL，配置成1 mg·mL-1酶储存液，4 ℃冰箱保存，临用前用PBS稀释至所需浓度。

（3）底物。称取0.285 0 g α-乙酸萘酯溶于无水乙醇，并定容至100 mL得到0.015 mol·L-1α-乙酸萘酯溶液；临用前用无水乙醇稀释至所需浓度；底物现配现用。

（4）显色剂。称取50 mg固蓝B盐溶于蒸馏水，并定容至10 mL，配制成0.5%固蓝B盐储存溶液，避光并放置4 ℃冰箱保存；临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。

（5）终止剂。称取10 g SDS溶解于40 g蒸馏水中配制成20% SDS溶液，移取2.5 mL、5 mL、7.5 mL 20% SDS溶液稀释定容至10 mL制备成5%、10%、15% SDS溶液。

（6）α-萘酚系列标准溶液的配制。称取0.144 g α-萘酚溶于丙酮，并定容至10 mL，得到0.1 mol·L-1α-萘酚溶液；移取 100 μL 0.1mol·L-1α-萘酚溶液使用丙酮稀释定容至10 mL，得到1×10-3mol·L-1α-萘酚溶液；临用前用丙酮稀释至所需浓度。

（7）联苯菊酯标准溶液的配制。称取10 mg联苯菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1联苯菊酯标准溶液；移取800 μL 1 mg·mL-1联苯菊酯标准溶液，使用甲醇稀释定容至100 mL，得到8 μg·mL-1联苯菊酯储备液；临用前用甲醇稀释至所需浓度。

（8）甲氰菊酯标准溶液的配制。称取10 mg甲氰菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1甲氰菊酯标准溶液；移取800 μL1 mg·mL-1甲氰菊酯标准溶液，使用甲醇稀释定容至100 mL，得到8 μg·mL-1甲氰菊酯储备液；临用前用甲醇稀释至所需浓度。

（9）6 mol·L-1盐酸。浓盐酸（12 mol·L-1）与蒸馏水1∶1混合。

1.2.2 产物最大吸收波长的确定

在紫外可见分光光度计400～700 nm扫描α-萘酚与显色剂固蓝B盐偶氮化反应生成红色物质的吸收光谱，确定水解产物α-萘酚用分光光度法的最佳测定波长。

1.2.3 终止剂SDS的确定

分 别 移 取 4.0 mL PBS、0.25 mL 4×10-4mol·L-1α-萘酚标准工作溶液加入离心管中混合均匀，然后加入0.25 mL不同浓度的终止剂（0%、5%、10%、15%和20%的SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定终止剂的最佳浓度。

1.2.4 显色剂固兰B盐的确定

分别移取4.0 mL PBS、0.25 mL α-萘酚标准工作溶液加入离心管中混合均匀，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL不同浓度显色剂（0.03%、0.04%、0.05%和0.06%固兰B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定显色剂的最佳浓度。

1.2.5 α-萘酚显色反应标准曲线

分别移取4.0 mL PBS、0.25 mL系列α-萘酚标准工作溶液加入离心管中混合均匀，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，绘制α-萘酚显色反应的标准曲线。

1.2.6 底物最佳浓度的确定

分别移取 50 μL 4 μg·mL-1酶液、3.95 mL PBS、0.25 mL 不同浓度底物（0 mol·L-1、3×10-4mol·L-1、7.5×10-4mol·L-1及 15×10-4mol·L-1α-乙酸萘酯）加入离心管中混合均匀，在40 ℃水浴中加热15 min，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定最佳底物浓度。

1.2.7 酶液最佳浓度的确定

分别移取 50 μL 不同浓度酶液（0 μg·mL-1、1 μg·mL-1、3 μg·mL-1、5 μg·mL-1及 7 μg·mL-1猪 肝 羧 酸 酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入离心管中混合均匀，在40 ℃水浴中加热15 min，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定最佳酶液浓度。

1.2.8 最佳反应温度的确定

分别移取50 μL酶液（猪肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入离心管中混合均匀，在不同温度下（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃以及60 ℃）水浴加热15 min，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定最佳反应温度。

1.2.9 最佳显色反应时间的确定

分别移取50 μL酶液（猪肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入离心管中混合均匀，在最佳反应温度下水浴加热15 min，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀，显色反应不同的时间（15 s、30 s、60 s、90 s以及120 s），加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，确定最佳显色反应时间。

1.2.10 拟除虫菊酯类农药对酶的抑制效果

分别移取50 μL酶液（猪肝羧酸酯）、3.7 mL PBS、0.25 mL不同浓度的拟除虫菊酯类农药标准工作液（联苯菊酯或甲氰菊酯）加入离心管中，混合均匀，涡旋30 s，静置10 min；加入0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）混合均匀，在最佳反应温度下水浴加热15 min，然后加入0.25 mL终止剂（SDS），0.25 mL显色剂（固蓝B盐），涡旋混匀30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1盐酸，摇匀后吸取3 mL待测液于比色皿中，放入多功能食品安全检测仪中，在最佳检测波长下测定吸光度值，测定联苯菊酯对酶的抑制效果。

2 结果与分析

2.1 产物最大吸收波长的测定

按1.2.2方法进行测定，结果见图2。

图2 α-萘酚与固蓝B盐显色反应的吸收光谱图

由图2可知，羧酸酯酶水解底物（α-乙酸萘酯）生成的水解产物α-萘酚与显色剂固蓝B盐偶氮化反应生成红色物质在536.6 nm处有最大吸收峰，因此选择536 nm为分光光度法检测水解产物α-萘酚的最佳测定波长。

2.2 终止剂SDS的确定

按1.2.3方法进行测定，结果见图3。

图3 不同浓度SDS对显色产物的影响图

据文献报道，终止剂SDS的作用是裂解肽链，从而使催化水解的猪肝羧酸酯酶失活，让水解反应终止，同时SDS的加入会影响显色产物的稳定性[11-12]。实验显示，SDS浓度为0时，α-萘酚与固蓝B盐的显色产物开始为红色，但很快颜色就退去，且溶液中析出灰黑色絮状物，吸光度值偏低。而随着SDS浓度的不断增加，显色产物的吸光度值逐渐升高，显色情况也越来越稳定，SDS浓度达到15%吸光度值趋于平缓。因受限于SDS溶解度，浓度为20%以上的SDS溶液放置一段时间后容易析出，因此选择更稳定的15%SDS溶液为最佳的终止剂。

2.3 显色剂固兰B盐的确定

按1.2.4方法进行测定，结果见图4。

图4 不同浓度显色剂对显色产物的影响图

显色剂的用量也是影响显色稳定性的重要因素。显色剂浓度越大时，颜色的蜕变越明显，显色剂浓度太小容易造成显色不足。固蓝B盐与α-萘酚发生偶氮化反应，扩大共轭体系，生成显色产物。由图4可知，0.05%以上的固兰B盐与水解产物α-萘酚的显色反应稳定并有良好的线性关系。因此过量的固兰B盐有利于反应的稳定性，而固蓝B盐见光易分解，因此选择0.06%的固蓝B盐为最佳浓度的显色剂。

2.4 α-萘酚显色反应标准曲线

将 不 同 浓 度 的 0 mol·L-1、0.5×10-4mol·L-1、1×10-4mol·L-1、2×10-4mol·L-1、4×10-4mol·L-1以 及6×10-4mol·L-1α-萘酚标准工作溶液按1.2.5的方法进行测定，结果见图5和图6。

图5 不同浓度α-萘酚标准溶液与固蓝B盐的显色反应情况图

图6 α-萘酚显色反应标准曲线图

由图5和图6可知，水解产物α-萘酚与显色剂固蓝B盐显色反应生成的红色物质随着α-萘酚浓度的增大而颜色加深，且在0～6×10-4mol·L-1α-萘酚标准工作溶液浓度范围内，与吸光度值成线性相关，R2=0.999 6。

2.5 底物最佳浓度的确定

按1.2.6的方法进行测定，结果见图7。

图7 不同浓度α-乙酸萘酯的显色反应图

由图7可知，随着底物α-乙酸奈酯浓度的不断增加，显色产物的吸光度值也随之上升，当α-乙酸奈酯浓度超过7.5×10-4mol·L-1时，吸光度值随着底物浓度的增加变化不大，因此选择α-乙酸萘酯的最佳反应浓度为 7.5×10-4mol·L-1。

2.6 酶液最佳浓度的确定

按1.2.7方法进行测定，结果见图8。

由图8可知，随着猪肝羧酸酯酶浓度的增加而显色产物吸光度值也增大，且为线性相关，R2=0.995 8，选择吸光度值为0.8以上即猪肝羧酸酯酶浓度为5 μg·mL-1为最佳酶液浓度。

图8 不同浓度的猪肝羧酸酯酶的显色反应图

2.7 最佳反应温度的确定

按1.2.8方法进行测定，结果见图9。

图9 不同水浴温度的显色反应图

温度对酶的活力有较大影响，从图9可知，温度升高，猪肝羧酸酯酶的酶活力逐渐升高，在45 ℃时达到最高，水解底物后生成的显色物质吸光度值最大，而后随着温度继续升高，酶活力反而有所下降，因此选择45 ℃为最佳反应温度。

2.8 最佳显色反应时间的确定

按1.2.9方法进行测定，结果见图10。

图10 不同显色反应时间的显色反应图

显色反应时间会影响水解产物α-萘酚和固蓝B盐的显色反应完全程度。由图10可知，15 s显色反应时间过短，显色反应未能完全进行，超过30 s后，显色反应时间过长，显色产物不稳定导致吸光度值有所下降。据文献报道，显色产物稳定存在于酸性环境中，故在显色反应完成后需在溶液中加入6 mol·L-1盐酸将溶液pH调节到酸性，使显色产物稳定不变[11]。显色反应时间加长，将延长加入6 mol·L-1盐酸调节pH的时间，导致显色产物不稳定发生褪色现象，因此选择30 s为最佳显色反应时间。

2.9 拟除虫菊酯类农药对酶的抑制效果

按1.2.10方法进行测定，加入0.25 mL联苯菊酯或甲氰菊酯标准工作液 1.6 μg·mL-1、3.2 μg·mL-1、4.8 μg·mL-1、6.4 μg·mL-1以及 8 μg·mL-1，使混合溶液中联苯菊酯或甲氰菊酯标准溶液浓度为0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1以及 0.5 μg·mL-1，结果见图11和图12。

图11 联苯菊酯对酶的抑制效果图

图12 甲氰菊酯对酶的抑制效果图

由图11和图12可知，当联苯菊酯和甲氰菊酯浓度达到0.1 μg·mL-1时即对猪肝羧酸酯酶产生了明显的抑制效果，且随着联苯菊酯和甲氰菊酯标准溶液浓度的增加，抑制效果更显著，显色产物逐渐减少，吸光度值下降，当联苯菊酯浓度达到0.3 μg·mL-1、甲氰菊酯浓度达到0.4 μg·mL-1时，抑制程度达到最大。因此拟除虫菊酯类农药对猪肝羧酸酯酶有明显的抑制效果，能影响猪肝羧酸酯酶催化α-乙酸萘酯水解的能力，使水解产物减少并无法与固蓝B盐形成显色产物。

3 结论

通过紫外可见分光光度计在400～700 nm光谱扫描发现，猪肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯的水解产物α-萘酚与固蓝B盐显色反应的产物在536 nm处有最大吸收峰；通过优化终止剂和显色剂浓度，在终止剂为15% SDS和显色剂为0.06%固蓝B盐条件下，水解产物α-萘酚能与固蓝B盐生产稳定的红色显色产物，且在α-萘酚0～6×10-4mol·L-1范围内与显色产物吸光度值成线性相关，R2=0.999 6。因此在536 nm最佳测定波长下，可以用分光光度法检测猪肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯后与固蓝B盐的显色反应。

通过优化酶水解显色反应的关键因素包括底物、酶液、反应温度和显色反应时间等，建立基于分光光度法的拟除虫菊酯类农药残留快速检测方法，以酶液为 5 μg·mL-1猪肝羧酸酯酶、底物为 7.5×10-4mol·L-1、终止剂为15%SDS、显色剂为0.06%固蓝B盐、pH调节剂为6 mol·L-1盐酸，在536 nm波长下检测显色产物的吸光度值，当联苯菊酯和甲氰菊酯浓度达到0.1 μg·mL-1时即对猪肝羧酸酯酶产生了明显的抑制效果，拟除虫菊酯类农药使猪肝羧酸酯酶降低了催化α-乙酸萘酯水解的能力，导致水解产物减少并无法与固蓝B盐形成显色产物，吸光度值降低。该方法操作简单，适宜基层人员现场操作，满足快速检测的需求。