大麦草青贮优良菌株选育与应用

安 琦，曹亚彬，牛彦波，原 韬

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

大麦草是具有丰富营养价值且耐盐碱的优质牧草。我国养殖业规模逐渐扩大，牧草需求也不断增加[1]，在探索和寻求饲料原料新来源的过程中，开发利用盐碱土地，种植高耐受性作物大麦草被认为是解决畜牧饲料匮乏的办法之一。大麦草具有多种饲喂方式，不但能够直接放牧进食，还可以制备便于存储的青贮饲料或晒制成干草。不论是青贮或是干草，都可以满足牧草短缺季节饲料供应的需求。与干草相比，青贮具备更好的适口性和更丰富的营养，能够为进食动物建立更健康的肠道体系，提高畜禽综合免疫能力。因此，与晾晒干草相比，青贮大麦草是更加科学合理的贮存方式[2]。经过青贮制备后的大麦草饲料富含丰富的蛋白质，青贮过程中维生素、矿物质得到了充分保留，为进食动物获取均衡的营养来源提供了充分保障。经过青贮发酵后，大麦草口感得到进一步提升，具备了与水果相似的香味，可促进动物进食。

目前，在大麦草青贮生产中还存在不少技术难题，其中比较突出的问题是大麦草本身附着乳酸菌少，青贮生产若使用天然乳酸菌，发酵速度较慢，不利于生产，会造成较大的经济损失[3-4]。市面上缺乏适用于大麦草青贮的专用青贮接种剂，外源接种剂普遍难以适应大麦草青贮环境，应用后竞争能力低、发酵启动慢、生产中会造成比较大的物料消耗[5-6]。以大麦草作为初始底物，经过筛选鉴定得到产酸杆菌共11株，针对这些菌株开展产酸检测，筛选出优良菌株，利用16sr DNA方法检测，通过BLAST比对，得到1株优良的大麦草青贮发酵菌株，确定为植物乳杆菌。通过与野生大麦草乳酸菌及市售非专用青贮菌株进行对比，分离纯化得到的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在生长速度、产酸能力、发酵青贮品质等方面具有优势，有望应用于大麦草青贮生产中。

1 材料与方法

1.1 材料

大麦草自然青贮样品由饲料企业提供；植物乳杆菌1431、1426株分离自玉米秸秆青贮饲料和市售青贮接种剂商品。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选与鉴定

采集自然大麦草青贮作为实验样品，按比例稀释后，利用加钙的MRS固体培养基进行筛选。采用平板稀释方法分离乳酸菌菌株，在平板上挑取溶钙圈较大的菌落，纯化菌株，转接斜面培养基保存。复筛使用MRS液体培养基(添加4%葡萄糖)，接种后28℃静止培养48 h后采用滴定法检测总酸。复筛选生产菌株，切碎的大麦草与水按1∶3比例混合搅匀后进行过滤，滤液中补加0.5%葡萄糖，接种目的菌株后于28℃静置培养，定期检测菌株的生长速度快和产酸能力，选取生长速度快、产酸能力强的菌株进行16srDNA鉴定。

1.2.2 大麦草青贮制备

将大麦草切碎至约4 cm后进行灭菌处理，接种2.5%乳酸菌菌液后充分混合，用抽真空袋进行分装，每袋装入约500 g大麦草，于28℃静置培养，定期检测总酸与pH。

1.2.3 青贮生产实验

粉碎的大麦草与稻糠按10∶1进行混合后接种2.5%乳酸菌菌液，充分混匀，密封打包后室温放置30 d，定期开包检查青贮效果，每次生产可加工7 t大麦草。

1.2.4 数据处理与分析

所有采集数据采用 Excel 软件进行前期处理，用 SPSS 19.0 进行统计分析，进行多重比较，结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 初筛菌株的分离及产酸能力检测

在自然大麦草青贮样品中分离出目的菌株11株。对初筛菌株于4%葡萄糖MRS液体培养基中28℃静止培养48 h后，检测其总酸含量，结果如表1。初筛菌株1729、1723、1730的产酸能力较高，与其他菌株存在显著性差异(P<0.05)。

表1 初筛菌株产酸能力测定Tab.1 Determination of acid production capacity of primary screening strains

2.2 复筛菌株生长速度检测

乳酸菌在青贮中的起始浓度和生长速度对青贮至关重要。为了筛选出具有生长优势的乳酸菌，对复筛菌株1723、1729、1730的生长速度进行简单的测定，相同的培养条件下，菌株1723的菌体数量显著高于菌株1729和1730(P<0.05)，生长速度显著快于其他菌株。

表2 复筛菌株菌体生长速度Tab.2 Growth rate of re-screened strains

2.3 菌株对大麦草的青贮能力

将筛选出的大麦草青贮菌株1723、分离自玉米秸秆青贮饲料的菌株1431、分离自市售青贮接种剂商品1426共3株植物乳杆菌的产酸情况进行比较，每隔12 h监测其产酸情况。结果如表3所示，在青贮前期8 h、16 h，大麦草青贮菌株1723产酸速度显著快于其他两株非专用菌株。24 h后，菌株1723和菌株1431的产酸值具有显著性差异，与菌株1426无显著差异性。由此可见，在青贮前期菌株1723具有显著性的产酸优势(P<0.05)。

表3 不同菌株对大麦草的青贮能力Tab.3 Silage capacity of different strains to barley grass

2.4 菌株鉴定结果

对菌株1723进行鉴定，如图1所示，经16srDNA扩增后，在1 700 bp左右出现目的扩增产物。对扩增产物进行测序后，与Genbank进行序列BLAST比对，结果如图2所示，目的菌株1723与植物乳杆菌的相似度为99%。

图1 目的菌株的比对结果Fig.1 Comparison results of target strains

图2 目的菌株的比对结果Fig.2 Comparison results of target strains

2.5 青贮的发酵品质

使用植物乳杆菌1723、1426、1431对大麦草进行青贮30 d后对其发酵品质进行评估。如表4所示，感官指标显示，青贮物料均未腐败，呈现绿黄色，伴有清香甜味。大麦草专用菌株1723的青贮pH和氨肽氮/总氮显著低于其他两组(P<0.05)，而其有机酸含量和中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维指标差异不显著(P>0.05)。

表4 青贮的发酵品质Tab.4 Quality of ferment Silage

3 讨论

随着畜牧产业的发展，饲料原料来源覆盖日益广泛。大麦草具有丰富的营养，是新兴的饲料原料[7]。大麦草可以制备为青贮饲料，应用于冬春季饲喂。青贮饲料与干饲料相比，适口性好，营养价值高[8-9]。在制备青贮饲料的过程中，由于大麦草携带乳酸菌数量低，依靠自身乳酸菌进行天然发酵速度较慢，发酵效果不理想[10-11]。若采用市售通用青贮接种剂，外源乳酸菌对大麦草适应性较低，缺乏环境竞争力，生产中易造成较大损失。因此，由大麦牧草出发分离纯化适用于大麦牧草的青贮用乳酸菌株具有较高的应用价值，经过分离筛选，核酸水平鉴定，分离出源自大麦牧草的植物乳杆菌菌株。经过产酸能力检测、生长速度测定与回接青贮实验，与野生乳酸菌株和非大麦草青贮商品菌株进行对比，生长速度产酸能力均优于野生及非专用商品菌株。该菌株作为大麦牧草来源的青贮饲料发酵专属菌株，具有更好的物料适应性，更高的发酵环境竞争优势，可提高生产速度，降低生产过程中的物料损失，提高了大麦牧草产品品质和生产利润，有望在大麦牧草青贮生产中推广应用。