宫颈癌及癌前病变宫颈组织中miR-548b、CIP2A表达及与HPV感染关系
2022-01-20刘晓旭苏学艳王素娟梁建梅王亚凡
刘晓旭 苏学艳 王素娟 梁建梅 王亚凡
1.河北省石家庄市妇幼保健院(050000)；2.河北省石家庄市行唐龙州医院
宫颈癌(CC)在中国女性恶性肿瘤中发病率位居第二[1-2]。高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染宫颈后，可引起细胞恶性转化及连续增殖，在CC中起作用[3-4]； HPV及细胞学检测是临床筛查CC的主要手段，但两者易受其他因素影响，导致筛查特异性低，临床应用受限[5]。寻找与HPV感染、宫颈病变程度有关的指标尤为重要。研究发现，微小RNA-548b(miR-548b)在肝细胞癌中呈低表达，在肝细胞癌中发挥抑癌作用[6]；蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)在CC中表达水平较高，其参与并影响CC病理发展[7]。miR-548b-3p作为miR-548b的一员，可通过靶向调节CIP2A进而调节肝细胞癌发生发展[8]。但miR-548b在CC及癌前病变中的表达水平及其与CIP2A、HPV感染的关系鲜有报道。因此，本研究分析CC及癌前病变组织中miR-548b、CIP2A表达水平及其与HPV感染的相关性，为临床研究提供参考。
1 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性分析2018年12月—2020年11月本院诊治的CC患者47例(CC组)，宫颈癌前病变患者61例(癌前病变组)，宫颈炎患者45例(宫颈炎组)临床资料。纳入标准：①CC、癌前病变患者符合诊断标准[9]，经宫颈活检确诊；②宫颈炎患者为单纯的宫颈炎，无恶性病变。排除标准：①既往接受过宫颈手术治疗、物理治疗、放化疗；②合并心、肾、肝等重要器官功能不全、其他恶性肿瘤。患者及其家属签署知情同意书。研究方法获得本院伦理委员会批准。
1.2 试剂与仪器
TRIzolTMLS Reagent、High Capacity RNA-to-cDNATMKit、TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManTMUniversal PCR Master Mix均购买于Invitrogen，SYBR Green Realtime PCR Master Mix购买于TOYOBO，HPV DNA检测试剂盒购买于广州好芝生物科技有限公司。紫外分光光度计购买于Beckman，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪购买于ABI。
1.3 宫颈组织检测
1.3.1miR-548b取部分宫颈活检或手术切除的宫颈标本，加液氮，研碎，应用TRIzolTMLS Reagent提取总RNA，利用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit进行反转录，获得cDNA，使用TaqManTMUniversal PCR Master Mix制备反应体系，于qRT-PCR仪上扩增。miR-548b以U6为内参，引物序列见表1。miR-548b相对表达量以2-△△CT法计算。
1.3.2CIP2A取部分宫颈活检或手术切除的宫颈标本，根据TRIzolTMLS Reagent说明书抽提组织标本中的总RNA，使用紫外分光光度计测定总RNA浓度，随后，用High Capacity RNA-to-cDNATMKit合成cDNA，最后，采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix配制反应体系，进行扩增、测定。CIP2A以GAPDH为内参，引物序列见表1。CIP2A相对表达量以2-△△CT法计算。
表1 基因引物序列
1.3.2HPV采用HPV DNA检测试剂盒以聚合酶链反应-反向点杂交法。取受试者适量宫颈上皮细胞标本，加裂解液，提取DNA，PCR扩增，加2×SSC，0.1%SDS和PCR产物杂交，洗膜显色，判定HPV感染。质控点IC点须呈现蓝紫色斑点。
1.4 统计学方法
2 结果
2.1 一般情况
CC组年龄(58.5±10.0)岁(45～70岁)，体重(56.4±9.1)kg(45.1～68.8kg)；癌前病变组年龄(59.03±10.11)岁(45～70岁)，体重(56.9±9.5)kg(45.0～68.9kg)；宫颈炎组年龄(58.2±9.9)岁(45～70岁)，体重(56.6±9.4)kg(45.4～68.9kg)。3组年龄、体重无差异(P>0.05)，
2.2 各组宫颈组织miR-548b、CIP2A及HPV感染情况比较
宫颈炎组、癌前病变组、CC组宫颈组织miR-548b表达依次降低，CIP2A表达依次升高，HPV阳性感染率逐渐升高(均P<0.05)。见表2。
表2 各组宫颈组织中miR-548b、CIP2A水平及HPV感染情况比较
2.3 宫颈组织miR-548b、CIP2A表达与HPV感染相关性
以CC及宫颈癌前病变者宫颈组织miR-548b相对表达量平均值0.63为界限，分为<0.63为低表达(n=62)，≥0.63为高表达(n=46)。结果显示，宫颈组织miR-548b表达水平与CC及宫颈癌前病变者HPV感染呈负相关(P<0.05)。以CC及宫颈癌前病变者宫颈组织CIP2A相对表达量平均值1.88为界限，<1.88为低表达者(n=44)，≥1.88为高表达者(n=64)。结果显示，宫颈组织CIP2A表达水平与CC及宫颈癌前病变者HPV感染呈正相关(P<0.05)。见表3。
表3 宫颈组织检测指标表达与患者HPV感染相关性(例)
2.4 宫颈组织中miR-548b表达与CIP2A相关性
Pearson法分析显示，宫颈炎、癌前病变、CC患者宫颈组织中miR-548b表达水平均与CIP2A呈负相关(r=-0.431、-0.467、-0.475，P<0.05)。
2.6 宫颈组织miR-548b、CIP2A表达诊断CC价值
ROC曲线显示，宫颈组织miR-548b诊断CC的曲线下面积(AUC)为0.882(95%CI:0.829～0.935)，截断值为0.61，约登指数为0.620，其敏感度、特异性分别为89.4%、72.6%；宫颈组织CIP2A诊断CC的AUC为0.889(95%CI:0.832～0.947)，截断值为1.81，约登指数为0.677，其敏感度、特异性分别为89.4%、78.3%；二者联合诊断CC的AUC为0.945(95%CI:0.909～0.981)，约登指数为0.797，其敏感度、特异性分别为87.2%、92.5%。
3 讨论
目前，CC发病机制研究颇多，发病不仅与免疫功能异常、初产年龄小、炎症反应、多孕多产等有关，还与miRNA及癌基因表达失调、HPV感染等相关[10-11]。而HPV可通过黏膜侵入靶细胞，将DNA整合至宿主染色体上影响宫颈癌变，高危HPV是引发CC的危险因素[12-13]。另外，CC是一个渐变过程，宫颈上皮内瘤变是其癌前病变，病程较长[14]。因此，寻找与HPV感染、宫颈病变相关的指标，对及早诊治CC有积极意义。
miRNA可调控自噬、免疫炎症反应、信号转导、及细胞增殖、凋亡、侵袭等过程，与卵巢癌、乳腺癌、CC等关系密切[15-16]。研究发现，miR-548b-3p在肺癌患者中表达水平降低，可能通过调节有关信号通路而影响癌细胞增殖、凋亡发挥抑癌作用，可能是治疗肺癌的潜在靶标[17]；miR-548b-3p在乳腺癌患者中表达水平较低，过表达可通过靶向调节相关基因表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、迁移，有望成为诊治乳腺癌的标志物[18]。以上研究表明，miR-548b-3p可能在癌症中发挥抑癌作用。本研究显示，宫颈炎组、癌前病变组、CC组患者宫颈组织miR-548b表达水平逐渐降低，提示miR-548表达水平降低可能与CC及癌前病变有关，推测，miR-548b低表达可能影响信号转导，使其对宫颈细胞异常增殖、迁移的作用减弱，从而影响宫颈癌前病变及CC的病理进程，但具体机制有待结合基础研究证实。本研究中宫颈组织miR-548b诊断CC的AUC为0.882，提示miR-548b对CC有一定诊断价值，有助于辅助诊断CC。
CIP2A可促进细胞增殖，保证细胞表型转化，抑制细胞衰老及蛋白磷酸酶2A活性，在肿瘤生长中发挥关键作用[19-20]。研究发现，CIP2A在子宫内膜癌中表达水平升高，与患者总生存率降低有关[21]；在CC组织中高表达，与肿瘤淋巴结转移、浸润深度相关，可能影响CC患者预后不良[22]。本研究中CIP2A表达水平随宫颈病变程度增加而升高，提示CIP2A可能在宫颈癌前病变及CC中发挥关键作用。分析原因，高水平CIP2A可能促进宫颈细胞异常增殖能力，抑制细胞凋亡，从而促进CC病变进程，但仍需深入探讨其作用机制。本研究中宫颈组织CIP2A诊断CC的AUC为0.889，提示CIP2A可作为辅助判定CC发生的指标，有利于确定CC是否发生。
HPV感染是引发CC的重要因素，分析其与miR-548b、CIP2A的关系有助于更进一步评价及宫颈癌前病变关系。Tian等[23]研究认为， HPV16 E6可上调CIP2A表达，表明HPV16等病毒感染可能与CIP2A有关。本研究显示，宫颈炎组、癌前病变组、CC组HPV阳性感染率呈升高趋势，与何旻等[5]研究相符；且CC及宫颈癌前病变者HPV感染与宫颈组织miR-548b表达水平呈负相关，与CIP2A表达水平呈正相关，提示宫颈病变越严重、HPV阳性感染率越高，与 miR-548b、CIP2A表达水平及宫颈病变进展均有关。本研究中宫颈炎、癌前病变患者宫颈组织及CC患者癌组织中miR-548b表达水平均与CIP2A呈负相关，提示miR-548b可能与CIP2A共同影响宫颈病变过程，但机制有待深入探讨；进一步研究发现，宫颈组织miR-548b、CIP2A联合诊断CC的AUC及特异性均高于二者单项检测，且敏感度达87.2%，提示两者联合检测可提高诊断CC效能，有较高的临床参考价值。
综上，CC及癌前病变患者宫颈组织miR-548b表达下调、CIP2A上调，两者均与HPV感染相关，可能在CC及癌前病变发展中发挥重要作用；miR-548b、CIP2A联合检测可提高对CC有较好诊断价值。但本研究未对miR-548b、CIP2A在CC中的机制及CC及癌前病变患者中HPV感染类型的差异进行深入探讨，后续有待研究。
