妊娠期糖尿病孕妇肠道菌群、炎症因子及T细胞亚群分析

张中敏 王海艳 任春丽 刘艳芳

1.承德钢铁集团有限公司职工医院(067102)；2.承德医学院附属医院 ；3.河北省承德市妇幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)可导致母体和围产儿并发症，严重危害孕妇及新生儿健康和生命[1]。相关研究报道，妊娠期妇女的肠道细菌数量、组成成分及多样性均改变显著，超重孕妇由于肠道菌群分布不同可引起葡萄糖耐量受损形成GDM[2]；有研究指出，GDM孕妇存在机体免疫失衡，对血管和胰岛β细胞功能造成损害[3]；而有学者认为GDM发生时机体内多种免疫细胞可通过分泌细胞因子产生自身调节作用，T细胞通过产生白细胞介素2(IL-2)、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等介导与局部炎症有关的免疫应答以辅助抗体生成，并抑制胰岛β细胞正常功能，对母婴安全造成影响[4]。故评价GDM孕妇肠道菌群、炎症因子及T细胞亚群的水平有利于维护母婴健康，但目前此类报道较少。本研究就此进行分析，为临床防治GDM提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经本院医学伦理委员会批准，回顾性收集2016年1月—2018年1月本院产前检查并分娩的孕妇临床资料，孕妇均知情并签署同意书。纳入标准：①GDM诊断符合相关指南[5]；②单胎妊娠；③年龄22～35岁；④无严重感染性疾病且凝血功能正常。排除标准：①合并甲状腺疾病、高血糖危象及心、肝、肺等严重功能不全；②合并其他类型恶性疾病；③孕前糖尿病；④合并艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病。根据孕26～28周OGTT试验结果将健康孕妇132例作为对照组， GDM孕妇64例作为观察组。

1.2 资料收集

自制问卷调查表(经验证K=0.669)和临床病例，问卷调查剔除重复样本和不合格问卷。收集研究对象年龄、身高、体质指数(BMI)、孕期增长体重、吸烟史、饮酒史、孕产史、月经史、家族史、产检史、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)；超声检查评估胎儿大小并核对孕周，获取实验室检查结果和分娩情况。

1.3 肠道菌群检测

收集孕妇粪便样品常规处理后培养，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(迈瑞生物科技有限公司)行细菌总DNA提取；引物设计根据目标细菌16SrRNA，序列见表1；实时荧光定量PCR反应，产物特异性采用溶解曲线分析，每克粪便样品待测细菌基因的拷贝数采用标准曲线及Ct值，通过菌落形态、格兰染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落作为定量结果，肠杆菌采用计算发酵乳糖、染色镜检为G-杆菌的所有菌落，肠球菌采用计数有明显褐色圈、染色镜检为G-球菌的所有菌落；双歧菌采用食品卫生微生物检验双歧菌检验，乳杆菌采用G+无芽胞杆菌、触酶阴性、APICH50，拟,杆菌采用 G-无芽胞杆菌、API20A；梭杆菌采用G+芽胞杆菌。计数上述平板培养皿中菌落数作为定性结果，菌落数在培养液中未检出为阴性，统计肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌及梭杆菌阳性数。

表1 引物序列

1.4 炎性因子检测

取孕妇空腹静脉血血清，酶联免疫吸附试验法检测IL-2、CRP、TNF-α，仪器为FAITH-1600全自动生化分析仪(杭州中翰盛泰医疗器械有限公司)，试剂盒购自迈瑞生物医药公司。采用CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特生物科技有限公司)检测T细胞亚群，包括CD3+、CD4+、CD4+/CD8+，试剂盒由上海泰益医疗仪器设备有限公司生产。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0统计分析。计量资料比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用卡方检验；分析发生GDM单因素，并对各检测指标行多元线性回归，logistic回归方程分析发病危险因素；采用Spearman相关系数分析肠道菌群、炎性因子、T细胞亚群与GDM患者妊娠结局相关性。P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 临床资料特征

两组吸烟史、饮酒史、家族史、年龄、身高、月经周期、经期、分娩孕周、SBP、DBP等无差异(P>0.05)；孕前体重、BMI、孕期增长体重、完整产检、孕次、产次有差异(P<0.05)。见表2。

表2 两组临床资料比较

2.2 实验室指标分析

观察组IL-2、CRP、TNF-α值及肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、梭杆菌数量大于对照组，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值及双歧杆菌、乳杆菌数量小于对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组实验室指标比较

指 标 观察组(n=64)对照组(n=132)tPCRP(mg/L)6.88±1.064.19±0.9817.543<0.001TNFα(ng/L)6.03±1.174.11±1.0911.289<0.001CD3+(%)0.69±0.080.73±0.102.7950.006CD4+(%)0.40±0.110.47±0.133.710<0.001CD4+/CD8+1.07±0.331.32±0.344.873<0.001

2.3 发生GDM多因素logistic回归分析

乳酸杆菌和双歧杆菌数量、IL-2、CRP、TNF-α值、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+是妊娠期妇女发生GDM危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 发生妊娠期GDM多因素logistic回归分析

2.4 妊娠结局

观察组新生儿低血糖、巨大儿及剖宫产发生率高于对照组(P<0.05)，胎盘早剥、胎膜早破/早产发生率与对照组无差异(P>0.05)。见表5。

表5 两组妊娠结局比较[例(%)]

2.5 GDM孕妇肠道菌群、炎性因子、T细胞亚群与妊娠结局相关性

GDM孕妇乳酸杆菌、双歧杆菌、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+与剖宫产、巨大儿、新生儿低血糖呈负相关(P<0.05)，IL-2、CRP、TNF-α值与巨大儿、剖宫产呈正相关(P<0.05)，CD4+/CD8+与早产呈正相关(P<0.05)。见表6。

表6 GDM孕妇肠道菌群、炎性因子、T细胞亚群与妊娠结局相关性(r)

3 讨论

目前GDM发病机制主要归纳为：由自身能量代谢及细菌感染、创伤及缺血缺氧等非感染因素引起全身炎症介质释放，从而形成免疫机制受损反应，引起全身代谢异常反应综合征。相关研究已证实机体炎性应激反应及免疫功能对GDM发生和发展有重要价值，Zhang等[6]指出，GDM发生后免疫功能下降而炎性因子大量释放引起相关代谢失衡，进一步加重病情。细胞免疫是清除细胞内寄生微生物的最为有效防御反应，也是参与分娩后创口修复愈合主要免疫系统，T淋巴细胞亚群作为免疫细胞中最重要的细胞群在人体中扮演着免疫监视及免疫自稳等重要角色[7]。研究认为，CD8+可抑制B淋巴细胞功能，从而抑制抗体产生，CD4+/CD8+水平异常提示机体免疫功能受损[8]。Yu等[9]报道GDM患者体内免疫功能下降。本文GDM孕妇CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值小于健康孕妇，提示GDM孕妇免疫机制下降；GDM孕妇炎性因子IL-2、CRP、TNF-α值显著升高。Zhang等[10]研究证实免疫机制下降可损害孕妇胰岛β细胞功能和葡萄糖调节，此时多种免疫细胞可通过分泌细胞因子产生自身调节作用，进一步引起IL-2、CRP、TNF-α水平上调。既往对炎性因子水平在GDM患者中的作用有多项报道：姜艳等[11]认为GDM孕妇发生感染几率增大，IL-2、CRP、TNF-α值显著升高；吴一鸣[12]提出炎性因子参与GDM发生发展且发挥重要作用；Alajlan等[13]动物实验结果显示，炎症反应可提高早期胰岛细胞周期异常调控和基因异常转录。本文多因素结果显示炎CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、CRP、TNF-α值与妊娠结局具有相关性，进一步验证其在GDM发展中的关系。

肠道菌群通过在肠黏膜表面形成天然屏障来参与人体消化吸收、代谢等重要活动，且对免疫功能有一定调节促进作用。根据既往报道，肠道微生态是控制体重和能量代谢重要环境因素之一，其与代谢性疾病如肥胖、2型糖尿病、GDM合并症发生等密切相关[14-15]。Chong等[16]指出其还可调节血脂、预防发生心血管疾病。相关研究报道，T2DM患者肠道菌群结构明显不同于健康个体，其大肠杆菌、拟杆菌属等条件致病菌水平显著上调，肠道内厚壁菌门/均菌属细菌显著下调，双歧杆菌含量大幅减少[17]。王武华等[18]给予小鼠喂养不同膳食，发现高脂膳食小鼠肠道内双歧杆菌水平显著降低，其水平与空腹胰岛素水平及宿主葡萄糖耐受呈负相关关系。本研究GDM孕妇肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、梭杆菌数量增多而双歧杆菌、乳杆菌数量减少，而双歧杆菌、乳杆菌为GDM发生独立影响因素，考虑GDM发生后免疫机制和肠道活性菌数量下降，增加感染和疾病恶向发展机会。Ilario等[19]建立小鼠体外实验发现，肠道相关菌群可刺激炎性因子发生不同程度的趋向性，提示肠道菌群与免疫机制相关性。GDM孕妇体内氧化应激反应、晚期糖基化代谢作用升高，受损的内皮细胞可通过相关特异性通路激活炎性细胞，而高活性的双歧杆菌和乳酸杆菌总数能够调节炎症因子，降低胰岛素抵抗和血糖水平[20]。当各种原因引起肠道微生态环境遭到破坏出现肠道菌群失调时，可直接引起宿主循环系统中内毒素增加，诱发机体高炎性应激反应和加重代谢性疾病病情。GDM患者代谢产物增加可改变肠道PH值和厌氧环境，厌氧菌双歧杆菌、乳酸杆菌对肠道内环境变化最为敏感呈大幅度减少，导致机体炎症因子水平升高，导致疾病恶性循环。本文分析肠道菌群与妊娠结局相关性，发生乳酸杆菌、双歧杆菌与剖宫产、巨大儿、新生儿低血糖呈负相关，提示乳酸杆菌、双歧杆菌可负向调控妊娠结局。

综上所述，GDM发生后，肠道益生菌群数量、免疫功能降低而炎性反应增高，可增加不良妊娠结局发生率。对肠道菌群、炎性因子及T细胞亚群进行干预对降低GDM发生与不良结局可能有重要价值。但由于本研究受时间限制，收集病例数量有限，故有待扩大样本数作进一步研究。