人牙龈成纤维细胞诱导分化为神经样细胞的实验研究

苏建芳 宋鹏 董福生 刘慧娟 张艳宁 王洁

人体神经细胞是信息传递的最高层次，它们构成意识、思维、感觉（包括视觉、听觉、体感）和各种复杂运动的最高指挥中枢。然而，神经细胞比人体任何其他细胞都更加脆弱，且缺乏再生能力[1～5]。组织的再生依赖干细胞的存在，胚胎干细胞是一种全能干细胞，具有多向分化的能力。骨髓间充质干细胞也是一种多能干细胞。然而，组织干细胞在组织的再生修复中，具有更为重要的作用。已有研究证实，牙龈成纤维细胞具有多向分化的潜能[6～11]。本实验拟诱导人牙龈成纤维细胞分化为神经样细胞，探讨作为结缔组织细胞的人牙龈成纤维细胞分化为神经样细胞的可能性。

资料和方法

人牙龈成纤维细胞的原代培养：经河北医科大学口腔医院伦理委员会审批同意，留取临床阻生齿拔除后切除的正常牙龈组织，进行细胞原代培养。培养液选用含15%胎牛血清的低糖DMEM（100U/ml青霉素和100U/ml链霉素，pH为7.2）。当细胞长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

取处于对数生长期的第4代人牙龈成纤维细胞爬片，按照PV-9000免疫组化试剂盒说明书进行操作。0.01mol/L的PBS冲洗3min×3次；3%去离子水室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗3min×3次；在爬片上分别滴加一抗，即鼠抗人vimentin抗体，鼠抗人GFAP抗体，鼠抗人MAP-2抗体（抗体稀释的浓度为1：50）。37℃孵育1小时；PBS冲洗3min×3次；爬片上滴加试剂2，37℃孵育30分钟；PBS冲洗3min×3次；爬片上滴加试剂3，37℃孵育30分钟；PBS冲洗3min×3次；滴加DAB显色剂，室温显色5min。蒸馏水充分冲洗。苏木素复染10min，自来水冲洗；酸酒精浸泡1s，自来水冲洗；氨水浸泡3s，自来水冲洗；酒精梯度脱水；二甲苯透明，5min。中性树胶封片。显微镜下观察，拍照。

采用第4代对数生长期的人牙龈成纤维细胞进行诱导。15%胎牛血清的低糖DMEM，加入1mmol/Lβ-ME，20μmol/L RA，2%DMSO，连续诱导12天。每两天换一次液，分别收集神经样细胞（诱导组）和成纤维细胞（对照组）的培养液，冻存在-20℃冰箱，留作ELISA检测。

人牙龈成纤维细胞诱导12天后，将诱导的神经样细胞爬片。分别进行鼠抗人vimentin、GFAP、MAP-2单克隆抗体的免疫细胞化学染色，步骤同前。同时进行免疫荧光化学鉴定，爬片丙酮固定24h后，0.01mol/LPBS洗涤2min×3次。3% H2O2室温孵育切片10min。0.01mol/LPBS洗涤2min×3次。在爬片上分别滴加一抗（1:50），鼠抗人GFAP、MAP-2单克隆抗体，37℃孵育2h。0.01mol/L PBS洗涤2min×3次：滴加10μg/ml DAPI染色剂复染细胞核，37℃孵育30min：0.01mol/L PBS洗涤2min×3次。滴加荧光素FITC和Rhodamine标记的二抗，37℃孵育30min，避光。0.01mol/L PBS洗涤2min×3次。蒸馏水洗1min×2次。甘油封片。共聚焦显微镜下观察，拍照。

神经样细胞的分泌功能的鉴定，分别采用人多巴胺和人乙酰胆碱ELISA试剂盒，对诱导后的神经样细胞培养液以及人牙龈成纤维细胞培养液（对照组）进行测定。培养液离心，3000rpm，20min，标准品的加样按照说明书操作进行。样本加样，设两个空白孔，待测样品孔分别各设12个孔。在酶标包被板上待测样品孔，先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。封板膜封板，37℃温育30min。小心揭掉封板膜，每孔加满洗涤液，静置30s弃去，如此重复5次。显色：每孔先加入显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50 μl，37℃避光显色10min。每孔加终止液50μl，终止反应。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。将每组所得的吸光度数值用表示，并用统计学中配对t检验对两组数据进行统计学分析，得出P值。整理数据，绘制条图。同时计算所测得的神经递质的浓度。

结 果

牙龈组织块培养5～7天，可见组织周围有细胞爬出，细胞体呈梭形或者纺锤形，有突起，细胞轮廓明显，细胞体和细胞核大，核呈卵圆形，着色浅，核仁明显。随着时间的延长，组织块中游离出的细胞逐渐增多（图1，2）。人牙龈成纤维细胞表达vimentin，细胞质呈棕黄色，细胞核呈蓝色（图3）；而不表达GFAP和MAP-2（图4，5）。

图1 A、B人牙龈成纤维细胞的原代培养（倒置显微镜 ×100）

图3 A、B人牙龈成纤维细胞vimentin表达阳性（Polymer×400）

图4 A、B人牙龈成纤维细胞GFAP表达阴性（Polymer×400）

人牙龈成纤维细胞诱导5天后，成纤维细胞开始出现胞体的变化，由长梭形变为三角形或星形，细胞核变圆，细胞由两个突起变为三个甚至多个突起，突起细而长，有树突样和轴突样结构出现，突起之间互相连接成网状。细胞开始出现神经样细胞的改变。随着诱导天数的增加，发生形态变化的细胞数目增多，诱导12天后，几乎所有细胞的形态变为神经样细胞（图6～9）。

图2 A、B人牙龈成纤维细胞的传代培养（倒置显微镜 ×200）

图5 A、B人牙龈成纤维细胞MAP-2表达阴性（Polymer×400）

图6 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体三角形或多边形，细胞多突起，连接成网（箭头示）（倒置显微镜 ×200）

免疫细胞化学鉴定神经样细胞，发现神经样细胞均表达vimentin、GFAP和MAP-2（图10～12）。免疫荧光鼠抗人GFAP抗体FITC染色，神经样细胞的胞质呈现绿色荧光，细胞核被DAPI染成蓝色（图13）。鼠抗人MAP-2抗体Rhodamine染色，神经样细胞的胞质呈现红色荧光，细胞核被DAPI染成蓝色（图14）。

图7 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体三角形，多突起（箭头示）（倒置显微镜 ×200）

图8 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体多边形，细胞突起细而长（箭头示）（倒置显微镜 ×400）

图9 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体多边形或三角形，细胞多突起（箭头示）（倒置显微镜 ×400）

图10 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体多边形或三角形，细胞多突起，vimentin表达阳性（Polymer×400）

图11 A、B人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体多边形或三角形，细胞多突起，GFAP表达阳性（Polymer×400）

图13 A、B.人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，GFAP表达阳性（FITC×200）

图14 A、B.人牙龈成纤维细胞诱导分化的神经样细胞，胞体三角形，多突起，彼此连接，MAP-2表达阳性（Rhodamine×200）

神经样细胞分泌功能的检测，采用人多巴胺ELISA试剂盒检测，神经样细胞多巴胺的含量（0.501±0.042）明显高于对照组（0.089±0.012），差别有显著性（P＜0.05）（图15）。采用人乙酰胆碱ELISA试剂盒检测，神经样细胞乙酰胆碱的含量（0.440±0.064）明显高于对照组（0.061±0.014），差异具有统计学意义（P＜0.05）（图16）。分别计算得出神经样细胞培养液中乙酰胆碱与多巴胺的浓度。乙酰胆碱的浓度为75pg/ml；多巴胺的浓度为56.25pg/ml（图17）。

图16 A.神经递质乙酰胆碱检测的ELISA标准品曲线。B.神经样细胞乙酰胆碱的分泌量明显高于对照组，差别有显著性（P＜0.05）。

图17 神经样细胞分泌的神经递质乙酰胆碱和多巴胺的浓度比较

讨 论

一、人牙龈成纤维细胞诱导分化为神经样细胞的可能性

干细胞从组织来源上可以分为胚胎干细胞和成体干细胞，从不同的分化潜能又可以分为全能干细胞，多能干细胞和专能干细胞。几乎所有的组织中都存在成体干细胞，自Gronthos[12]等首次从牙髓中分离培养出牙髓干细胞，随后研究者们在牙体组织中又发现了不同种类的干细胞，如脱落乳牙中的干细胞[13]，根尖干细胞[14]，牙囊干细胞[15]以及牙周膜干细胞[16，17]。在口腔牙龈的固有层中，存在一些未分化的间充质干细胞[5]。Xinbo Yu[18]等将在体外分离培养的人牙龈间充质干细胞用强的绿色荧光蛋白标记以后，植入牙周组织被造成三级损伤的比格犬体内，结果发现Beagle犬的牙周组织，包括牙槽骨，牙骨质和牙周膜等的修复，都得到了极大的改善。

成体干细胞的“可塑性”（Plasticity）[15]指成体干细胞不仅具有多向分化潜能，而且相同胚层或不同胚层起源的成体干细胞之间在一定条件下可相互转化。人体有四大组织，上皮组织，结缔组织，肌组织和神经组织。口腔牙龈组织的细胞成分，主要为成纤维细胞。已有研究证实，牙龈成纤维细胞有分化为骨[19]、软骨[20]，血管内皮细胞[9]，血管平滑肌细胞[7]和骨骼肌[11]细胞的能力。本实验室的刘旭倩等[6～9]将人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，利用兔的脱细胞血管支架，构造成组织工程化血管。本实验室的武明轩等[10]采用牙龈成纤维细胞为种子细胞，构建“三明治”牙周复合体，修复牙周创伤。

以上研究提示，牙龈成纤维细胞具有多向分化潜能，即具有干细胞的可塑性。而且牙龈组织具有其自身的优势。牙龈一般取自于阻生智齿拔除术，牙冠延长术等的患者，取材方式容易被患者所接受，而且牙龈是包围和覆盖在牙颈部和牙槽嵴的口腔黏膜，其位置表浅，取材方便，受损后修复增殖能力强，且不留瘢痕等。其次，在细胞培养的过程中发现，牙龈成纤维细胞可塑性强，增殖力强。所以，牙龈成纤维细胞可以作为诱导神经样细胞的一个较为理想的细胞来源。

二、人牙龈成纤维细胞诱导的神经样细胞的形态特征

神经组织主要由神经细胞和神经胶质细胞组成。神经细胞也称神经元。神经元的形态不一，但都可以分为胞体，树突和轴突三部分。神经元的胞体有圆形，锥形，梭形和星形等，细胞核大而圆，核仁也大而圆，每个神经元有一个轴突，一个至多个树突，树突形如树枝状，在分支上常可见大量短小的突起，称为树突棘。

诱导完成的神经样细胞，胞体呈现三角形或者多边形，细胞伸出又细又长的突起，突起之间互相连接，形成网络状的结构，且可以看到树突样和轴突样，以及树突棘等神经细胞特有的结构。胞核圆形或者椭圆形。

神经样细胞不仅具有形态特征，在细胞免疫表达上也与神经细胞相同。研究表明，牙龈成纤维细胞的鉴定具有其特异性的表面标志物，如波形蛋白（Vimentin）[21]。在正常的生理条件下，波形蛋白（Vimentin）存在于间充质干细胞中[22]。本实验采用鼠抗人vimentin单克隆抗体对分离培养后的人牙龈成纤维细胞，进行免疫细胞化学染色，染色结果为阳性。同时，采用神经元特异性表面标志物MAP-2和神经胶质细胞特异性表面标志物GFAP，染色结果为阴性。这提示实验中所采用的人牙龈成纤维细胞为间充质来源的结缔组织细胞，并非神经组织来源的细胞。而诱导后的神经样细胞不仅表达神经元特异性表面标志物微管相关蛋白（MAP-2）和神经胶质细胞特异性表面标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP），还表达波形蛋白（vimentin）。

三、人牙龈成纤维诱导的神经样细胞的分泌功能

体外维甲酸（RA）诱导神经细胞分化，也是有经典的维甲酸信号通路参与的[23]。维甲酸信号通路的破坏会直接导致运动神经元的退变，从而引起阿尔兹海默病甚至帕金森综合征等疾病的发生[24]。这两类神经系统退行性病变分别与胆碱能神经元和中脑黑质体中多巴胺能神经元的变性缺失有关。大鼠由多巴胺能激动剂触发的无目的口腔运动，被5-HT2C受体调节[25]。Bain等用0.1μmol/L的RA将胚胎干细胞诱导分化为神经元，且确认神经元分泌神经递质乙酰胆碱[26]。Wenyu Fu等用10-6M RA和胶质细胞源性神经营养因子将鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元[27]。

本实验用人乙酰胆碱和多巴胺的ELISA试剂盒，分别检测了神经样细胞和对照组的培养液，结果表明，神经样细胞中乙酰胆碱与多巴胺的含量明显高于对照组，差异具有统计学意义。说明本实验将人牙龈成纤维细胞诱导分化为的神经样细胞，具有分泌功能，可以分泌神经递质乙酰胆碱和多巴胺。目前尚未有报道哺乳动物或者人体的神经系统中胆碱能神经元是否能分泌多巴胺，或者多巴胺能神经元是否能分泌乙酰胆碱。本实验出现的结果，可能与体外将人牙龈成纤维细胞诱导为神经元样细胞，诱导试剂的使用，激活了人牙龈成纤维细胞的某条信号通路，使得神经样细胞同时具备了分泌两种神经递质的功能。

综上所述，本实验成功将人牙龈成纤维细胞，诱导分化为神经样细胞。并证实神经样细胞具备神经细胞的形态学特征和免疫学特性，且能分泌神经递质乙酰胆碱和多巴胺。