全反式维甲酸对M1型巨噬细胞极化的影响

薛高峰，王琳源，关宁，高秀秋

（锦州医科大学 1.附属第二医院牙周黏膜科；2.附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室，辽宁 锦州 121000）

巨噬细胞是免疫系统的重要成员之一，在组织修复和抑制炎症方面发挥重要作用。根据巨噬细胞在不同细胞因子作用下的极化特点，可分化为Ml（经典活化）型和M2（替代活化）型。巨噬细胞在干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ），脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的刺激下极化为Ml型巨噬细胞［1-3］，可分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白细胞介素-23（interleukin-23，IL-23），白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等炎性细胞因子［4-5］，参与慢性根尖周炎、慢性牙周炎、炎症性肠病等炎性疾病的发病过程［6-8］。抑制M1型巨噬细胞的极化可减轻组织炎症程度，促进炎症转归，维持组织稳态。

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）又称视黄酸、维甲酸等，是维生素A类衍生物，具有广泛的免疫调节作用，在免疫细胞分化、活化和维持免疫系统的稳定过程中发挥多种功能，用于治疗系统性红斑狼疮、炎症性肠病、类风湿性关节炎等多种免疫性疾病［9-12］。然而，目前国内外关于ATRA对M1型巨噬细胞极化的调控作用研究较少。本研究通过体外建立M1型巨噬细胞极化模型，探讨ATRA对M1型巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验采用8周龄、质量约20 g的SPF级 C57BL/6雌性小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司。本研究通过锦州医科大学动物伦理委员会审核批准。

1.2 实验材料

流式细胞仪（美国BD公司），实体显微镜（日本Olympus公司），RT-PCR仪和高速低温离心机（美国Thermo公司），涡旋混合仪（中国其林贝尔仪器制造厂），电子天平（中国赛多利斯天平有限公司），迷你离心机（中国昊诺斯生物公司），微量加样器（法国吉尔森公司），ATRA（中国Target MOL公司），RPMI1640培养基、胎牛血清（美国Invitrogen公司），F4/80抗体、iNOS抗体（美国Cell Signaling公司），Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒及反转录试剂盒（中国Vazyme公司），TRIzol（中国Ambion公司），iNOS、β-actin、TNF-α、IL-1β引物合成（中国鼎昌国盛有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 腹腔巨噬细胞的收集纯化：取8周龄的C57BL/6小鼠颈部断髓致死，无菌条件下用2%FBSPBS灌洗腹腔，收集腹腔液，离心并重悬细胞，台盼蓝拒染法计数活细胞＞95%，用RPMI1640完全培养基调整细胞密度，以一定细胞数接种于96孔培养板中，孵箱培养2 h后，吸上清液，去除未贴壁的细胞从而得到纯化后的巨噬细胞。

1.3.2 实验分组及条件：将细胞分为M组、M1组、DMSO组和ATRA组。见表1。IFN-γ（20 ng/mL）联合LPS（100 ng/mL）诱导巨噬细胞向M1型极化后，加入ATRA（30 μg/mL）进行干预，孵箱孵育24 h。

表1 实验分组及条件Tab.1 Experimental grouping and conditions

1.3.3 细胞形态学观察：细胞培养24 h后，用倒置显微镜（×100）观察各组细胞形态并进行拍照。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡：依照试剂盒说明书将各组细胞样本制成浓度为1×106/mL细胞悬液，吸取100 μL的重悬液到流式管中，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD Staining Solution，混匀，避光室温孵育10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，并用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

1.3.5 流式细胞术分析：将各组细胞悬液分别以细胞数1×106/管加入流式管并根据组别进行编号。用FITC标记的F4/80抗体以及相应的同型对照抗体进行胞外因子染色，用PE标记的iNOS抗体以及相应的同型对照抗体进行胞内因子染色，350 μL Staining Buffer洗涤重悬，流式细胞仪进行检测。以前向散射角和侧向散射角确定巨噬细胞群，应用FlowJo 7.6.1软件分析F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞。

1.3.6 实时PCR检测：收集各组细胞后用TRIzol法提取细胞总RNA。通过紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度。操作完成后将提取的RNA反转录合成cDNA。按照反转录试剂盒说明进行操作，配置20 μL反应体系，每孔内依次加入2 μL cDNA，10 μL 2×mix，上、下游引物各0.4 μL，无菌水7.2 μL，进行扩增。引物设计：iNOS上游引物序列为5’-GGG TCACAACTTTACAGGGAGT-3’，下游引物序列为5’-G AGTGAACAAGACCCAAGCG-3’；TNF-α上游引物序列为5’-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3’，下游引物序列为 5’-TTGCTACGACGTGGGCTACA -3’；IL-1β上游引物序列为5’-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3’，下游引物序列为 5’-TGTGCTGCGAGATTTGA-3’；以β-actin为内参照物，β-actin上游引物序列为5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物序列为 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件：预变性95℃、30 s；循环反应95℃、5 s；60℃、30 s，共40个循环；溶解曲线 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。每个样本做3个复孔，实验重复3次，取平均值。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，2组间均数比较采用配对t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜（×100）下观察4组细胞在体外培养24 h后的细胞形态学表现。M组细胞主要呈圆形或椭圆形；M1组和DMSO组细胞主要表现为肾形，长梭形，细胞表面可见伪足；ATRA组与M1组相比，梭形细胞数量减少，圆形细胞数量增加且伸出伪足减少。见图1。

图1 各组细胞形态学观察 ×100Fig.1 Cell morphology observation of each group ×100

2.2 各组细胞凋亡情况

Annexin V-PE/7-AAD双染法检测各组细胞凋亡情况，与M组相比较，M1组、DMSO组、ATRA组中细胞凋亡率无明显差异（P＞ 0.05）；与M1组相比，ATRA组中细胞凋亡率无明显改变，差异无统计学意义（P＞ 0.05）；M1组与DMSO组比较，差异也无统计学意义（P＞ 0.05）。见图2。

图2 巨噬细胞凋亡率的表达Fig.2 Expression of macrophage apoptosis rates

2.3 M1型巨噬细胞表达情况

LPS及IFN-γ共同处理后，与M组相比，M1组和DMSO组中F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞表达增加，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；与M1组比较，ATRA组中F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞表达显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。DMSO组与M1组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图3。

图3 M1型巨噬细胞的表达Fig.3 Expression of M1 type macrophages

2.4 实时PCR检测IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA表达情况

通过实时PCR检测各组细胞中M1型巨噬细胞相关因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达情况：与M组相比，M1组和DMSO组细胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；与M1组相比，ATRA组细胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；DMSO组和M1组M1型巨噬细胞相关因子mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

3 讨论

巨噬细胞是体内重要的吞噬和抗原提呈细胞，一方面通过非特异性识别抗原物质，对病原体进行吞噬，另一方面通过免疫应激，产生抗原提呈，启动机体的免疫应答［13］。巨噬细胞具有高度异质性，经LPS刺激可诱导为M1型巨噬细胞，高表达ROS、iNOS、IL-6、1L-1β等，具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性作用［14-15］。同时，iNOS和NO是NF-κB 信号转导通路中重要的2种信号转导分子，过量的致病性NO通过环氧合酶2可产生iNOS，介导组织损伤，引发炎症反应发生，与过敏性哮喘、糖尿病、肥胖等多种疾病的发病机制相关。

图4 M1型巨噬细胞相关因子IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA的表达Fig.4 Expression of IL-1β，iNOS，and TNF-α mRNA in M1-type macrophages

ATRA是维生素A的重要活性代谢物，可调节肿瘤细胞的分化和凋亡，临床中广泛应用于血液系统肿瘤的治疗［16-17］。近年来，有研究表明ATRA可通过调节巨噬细胞相关炎性细胞因子的产生，抑制炎症反应发生。HUNG等［18］研究发现ATRA可通过抑制JNK-AP-1信号通路表达减少iNOS、NO和COX-2等巨噬细胞炎性细胞因子的产生，从而保护LPS所致的机体损伤，发挥其抗炎作用。ZHANG等［19］发现ATRA也可通过直接激活蛋白激酶抑制LPS刺激的巨噬细胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS等的生成。这些研究结果说明，ATRA可通过多条信号通路来发挥其对巨噬细胞的调控作用。但是，ATRA能否对M1型巨噬细胞的极化产生作用还不完全清楚，本研究发现，巨噬细胞经过ATRA（30 μg/mL）处理后，M1型巨噬细胞比例及相关细胞因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达降低；并且通过细胞凋亡率检测发现，ATRA在浓度为30 μg/mL时对巨噬细胞无细胞毒性作用，表明ATRA（30 μg/mL）可有效抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。

ATRA可通过多种途径调节巨噬细胞极化。LI等［20］发现巨噬细胞可通过Toll样受体4（toll-like receptors 4，TLR4）激活IκB激酶（IκB kinase，IKK）复合物，从而调节巨噬细胞的M1型极化。而ATRA可通过抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）激活，阻断TLR4/NF-κβ信号通路的表达［21］；马志新等［22］发现巨噬细胞通过CD14和CR3激活磷脂酶C，产生蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3-激酶，从而活化PI3K/Akt通路，调节M1型巨噬细胞极化。而ATRA可通过抑制PI3K激活阻断PI3K/Akt信号通路的表达［23］，从而影响M1型巨噬细胞极化。因此，推测ATRA可能通过阻断多条信号通路的表达抑制M1型巨噬细胞的极化，这些机制可能是ATRA抑制M1型巨噬细胞极化的原因。

综上所述，本研究发现ATRA（30 μg/mL）对巨噬细胞无细胞毒作用且在体外可抑制M1型巨噬细胞极化，提示ATRA有可能成为一种用于治疗M1型巨噬细胞相关疾病的有效药物。值得注意的是，ATRA作为体内维生素A的代谢中间产物，可能通过多种机制来影响M1型巨噬细胞极化，其有关机制还有待于进一步研究。