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全反式维甲酸对M1型巨噬细胞极化的影响

2022-01-20薛高峰王琳源关宁高秀秋

中国医科大学学报 2022年1期
关键词:极化细胞因子引物

薛高峰,王琳源,关宁,高秀秋

(锦州医科大学 1.附属第二医院牙周黏膜科;2.附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室,辽宁 锦州 121000)

巨噬细胞是免疫系统的重要成员之一,在组织修复和抑制炎症方面发挥重要作用。根据巨噬细胞在不同细胞因子作用下的极化特点,可分化为Ml(经典活化)型和M2(替代活化)型。巨噬细胞在干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ),脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)的刺激下极化为Ml型巨噬细胞[1-3],可分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23),白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等炎性细胞因子[4-5],参与慢性根尖周炎、慢性牙周炎、炎症性肠病等炎性疾病的发病过程[6-8]。抑制M1型巨噬细胞的极化可减轻组织炎症程度,促进炎症转归,维持组织稳态。

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)又称视黄酸、维甲酸等,是维生素A类衍生物,具有广泛的免疫调节作用,在免疫细胞分化、活化和维持免疫系统的稳定过程中发挥多种功能,用于治疗系统性红斑狼疮、炎症性肠病、类风湿性关节炎等多种免疫性疾病[9-12]。然而,目前国内外关于ATRA对M1型巨噬细胞极化的调控作用研究较少。本研究通过体外建立M1型巨噬细胞极化模型,探讨ATRA对M1型巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验采用8周龄、质量约20 g的SPF级 C57BL/6雌性小鼠,购自辽宁长生生物技术有限公司。本研究通过锦州医科大学动物伦理委员会审核批准。

1.2 实验材料

流式细胞仪(美国BD公司),实体显微镜(日本Olympus公司),RT-PCR仪和高速低温离心机(美国Thermo公司),涡旋混合仪(中国其林贝尔仪器制造厂),电子天平(中国赛多利斯天平有限公司),迷你离心机(中国昊诺斯生物公司),微量加样器(法国吉尔森公司),ATRA(中国Target MOL公司),RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Invitrogen公司),F4/80抗体、iNOS抗体(美国Cell Signaling公司),Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒及反转录试剂盒(中国Vazyme公司),TRIzol(中国Ambion公司),iNOS、β-actin、TNF-α、IL-1β引物合成(中国鼎昌国盛有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 腹腔巨噬细胞的收集纯化:取8周龄的C57BL/6小鼠颈部断髓致死,无菌条件下用2%FBSPBS灌洗腹腔,收集腹腔液,离心并重悬细胞,台盼蓝拒染法计数活细胞>95%,用RPMI1640完全培养基调整细胞密度,以一定细胞数接种于96孔培养板中,孵箱培养2 h后,吸上清液,去除未贴壁的细胞从而得到纯化后的巨噬细胞。

1.3.2 实验分组及条件:将细胞分为M组、M1组、DMSO组和ATRA组。见表1。IFN-γ(20 ng/mL)联合LPS(100 ng/mL)诱导巨噬细胞向M1型极化后,加入ATRA(30 μg/mL)进行干预,孵箱孵育24 h。

表1 实验分组及条件Tab.1 Experimental grouping and conditions

1.3.3 细胞形态学观察:细胞培养24 h后,用倒置显微镜(×100)观察各组细胞形态并进行拍照。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡:依照试剂盒说明书将各组细胞样本制成浓度为1×106/mL细胞悬液,吸取100 μL的重悬液到流式管中,加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD Staining Solution,混匀,避光室温孵育10 min,加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀,并用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

1.3.5 流式细胞术分析:将各组细胞悬液分别以细胞数1×106/管加入流式管并根据组别进行编号。用FITC标记的F4/80抗体以及相应的同型对照抗体进行胞外因子染色,用PE标记的iNOS抗体以及相应的同型对照抗体进行胞内因子染色,350 μL Staining Buffer洗涤重悬,流式细胞仪进行检测。以前向散射角和侧向散射角确定巨噬细胞群,应用FlowJo 7.6.1软件分析F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞。

1.3.6 实时PCR检测:收集各组细胞后用TRIzol法提取细胞总RNA。通过紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度。操作完成后将提取的RNA反转录合成cDNA。按照反转录试剂盒说明进行操作,配置20 μL反应体系,每孔内依次加入2 μL cDNA,10 μL 2×mix,上、下游引物各0.4 μL,无菌水7.2 μL,进行扩增。引物设计:iNOS上游引物序列为5’-GGG TCACAACTTTACAGGGAGT-3’,下游引物序列为5’-G AGTGAACAAGACCCAAGCG-3’;TNF-α上游引物序列为5’-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3’,下游引物序列为 5’-TTGCTACGACGTGGGCTACA -3’;IL-1β上游引物序列为5’-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3’,下游引物序列为 5’-TGTGCTGCGAGATTTGA-3’;以β-actin为内参照物,β-actin上游引物序列为5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’,下游引物序列为 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件:预变性95℃、30 s;循环反应95℃、5 s;60℃、30 s,共40个循环;溶解曲线 95℃、15 s,60℃、1 min,95℃、15 s。每个样本做3个复孔,实验重复3次,取平均值。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,2组间均数比较采用配对t检验,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜(×100)下观察4组细胞在体外培养24 h后的细胞形态学表现。M组细胞主要呈圆形或椭圆形;M1组和DMSO组细胞主要表现为肾形,长梭形,细胞表面可见伪足;ATRA组与M1组相比,梭形细胞数量减少,圆形细胞数量增加且伸出伪足减少。见图1。

图1 各组细胞形态学观察 ×100Fig.1 Cell morphology observation of each group ×100

2.2 各组细胞凋亡情况

Annexin V-PE/7-AAD双染法检测各组细胞凋亡情况,与M组相比较,M1组、DMSO组、ATRA组中细胞凋亡率无明显差异(P> 0.05);与M1组相比,ATRA组中细胞凋亡率无明显改变,差异无统计学意义(P> 0.05);M1组与DMSO组比较,差异也无统计学意义(P> 0.05)。见图2。

图2 巨噬细胞凋亡率的表达Fig.2 Expression of macrophage apoptosis rates

2.3 M1型巨噬细胞表达情况

LPS及IFN-γ共同处理后,与M组相比,M1组和DMSO组中F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞表达增加,差异有统计学意义(P< 0.01);与M1组比较,ATRA组中F4/80+iNOS+M1型巨噬细胞表达显著下降,差异有统计学意义(P< 0.01)。DMSO组与M1组间差异无统计学意义(P> 0.05)。见图3。

图3 M1型巨噬细胞的表达Fig.3 Expression of M1 type macrophages

2.4 实时PCR检测IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA表达情况

通过实时PCR检测各组细胞中M1型巨噬细胞相关因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达情况:与M组相比,M1组和DMSO组细胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P< 0.01);与M1组相比,ATRA组细胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达显著下降,差异有统计学意义(P< 0.01);DMSO组和M1组M1型巨噬细胞相关因子mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。

3 讨论

巨噬细胞是体内重要的吞噬和抗原提呈细胞,一方面通过非特异性识别抗原物质,对病原体进行吞噬,另一方面通过免疫应激,产生抗原提呈,启动机体的免疫应答[13]。巨噬细胞具有高度异质性,经LPS刺激可诱导为M1型巨噬细胞,高表达ROS、iNOS、IL-6、1L-1β等,具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性作用[14-15]。同时,iNOS和NO是NF-κB 信号转导通路中重要的2种信号转导分子,过量的致病性NO通过环氧合酶2可产生iNOS,介导组织损伤,引发炎症反应发生,与过敏性哮喘、糖尿病、肥胖等多种疾病的发病机制相关。

图4 M1型巨噬细胞相关因子IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA的表达Fig.4 Expression of IL-1β,iNOS,and TNF-α mRNA in M1-type macrophages

ATRA是维生素A的重要活性代谢物,可调节肿瘤细胞的分化和凋亡,临床中广泛应用于血液系统肿瘤的治疗[16-17]。近年来,有研究表明ATRA可通过调节巨噬细胞相关炎性细胞因子的产生,抑制炎症反应发生。HUNG等[18]研究发现ATRA可通过抑制JNK-AP-1信号通路表达减少iNOS、NO和COX-2等巨噬细胞炎性细胞因子的产生,从而保护LPS所致的机体损伤,发挥其抗炎作用。ZHANG等[19]发现ATRA也可通过直接激活蛋白激酶抑制LPS刺激的巨噬细胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS等的生成。这些研究结果说明,ATRA可通过多条信号通路来发挥其对巨噬细胞的调控作用。但是,ATRA能否对M1型巨噬细胞的极化产生作用还不完全清楚,本研究发现,巨噬细胞经过ATRA(30 μg/mL)处理后,M1型巨噬细胞比例及相关细胞因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表达降低;并且通过细胞凋亡率检测发现,ATRA在浓度为30 μg/mL时对巨噬细胞无细胞毒性作用,表明ATRA(30 μg/mL)可有效抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。

ATRA可通过多种途径调节巨噬细胞极化。LI等[20]发现巨噬细胞可通过Toll样受体4(toll-like receptors 4,TLR4)激活IκB激酶(IκB kinase,IKK)复合物,从而调节巨噬细胞的M1型极化。而ATRA可通过抑制核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)激活,阻断TLR4/NF-κβ信号通路的表达[21];马志新等[22]发现巨噬细胞通过CD14和CR3激活磷脂酶C,产生蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3-激酶,从而活化PI3K/Akt通路,调节M1型巨噬细胞极化。而ATRA可通过抑制PI3K激活阻断PI3K/Akt信号通路的表达[23],从而影响M1型巨噬细胞极化。因此,推测ATRA可能通过阻断多条信号通路的表达抑制M1型巨噬细胞的极化,这些机制可能是ATRA抑制M1型巨噬细胞极化的原因。

综上所述,本研究发现ATRA(30 μg/mL)对巨噬细胞无细胞毒作用且在体外可抑制M1型巨噬细胞极化,提示ATRA有可能成为一种用于治疗M1型巨噬细胞相关疾病的有效药物。值得注意的是,ATRA作为体内维生素A的代谢中间产物,可能通过多种机制来影响M1型巨噬细胞极化,其有关机制还有待于进一步研究。

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