EphA8在非小细胞肺癌中的表达及其预后价值*

王 伟，刘 颖，黄 芳，何 鑫，袁 傲，靳 钦，朱惠君，刘益飞

（南通大学附属医院病理科，江苏 226001）

近年来肺癌已成为世界范围内常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率高[1]，85%以上肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。由于NSCLC的高度侵袭性和对治疗的耐受性，易侵犯淋巴结或远处转移，5年生存率小于15%[2]，早期诊断和综合治疗是降低死亡率的关键。

受体酪氨酸激酶包含16个成员，分为EphA和EphB亚家族，其中EphA1-8、EphA10和EphB1-3与细胞表面配体Ephrin-A1-5和Ephrin-B结合[3]介导细胞间相互作用，产生细胞内信号传导，在上皮细胞中起着重要作用[4]。研究表明，EphA8（ephrin type-A receptor 8）与多种肿瘤的增殖、转移密切相关[3-6]。本文收集南通大学附属医院病理科2010年1月—2017年12月167例NSCLC肿瘤组织石蜡样本，制作组织芯片，应用免疫组织化学方法检测EphA8表达情况，回顾性分析EphA8表达与临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 手术切除并经病理诊断为NSCLC的肿瘤组织石蜡标本167例，其中男性92例，女性75例，年龄36～80岁，平均60±9岁，有吸烟史32例；肿瘤直径<3 cm 48例，≥3 cm 119例。肿瘤分期按照第八版TNM分期指南。本研究经南通大学附属医院伦理研究委员会批准。

1.2 免疫组织化学分析 组织芯片又称组织微阵列（TMA），其制作按照苏木精-伊红染色（H&E）结果，选择代表性癌区标记在石蜡块中，获得直径2 mm TMA样品。对TMA连续切片，切片厚度为4μm。经二甲苯脱蜡和梯度浓度酒精脱水后，用柠檬酸盐溶液（pH 6.0）加压煮沸20 min进行抗原修复。自然冷却至室温后，以3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭，以EphA8单克隆抗体（1∶200，OMI189940，Omnimabs，NJ）孵育，4℃冰箱过夜。次日复温后加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（Dako，Carpinteria，CA，USA）孵育，DAB显色，苏木素染胞核1 min，脱水，透明，封片，晾干。以PBS代替一抗作为空白对照。

1.3 染色结果观察 采用半定量双盲法评估，由两位主治以上病理学医师在显微镜下独立阅片。细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，染色强度计分:阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。按阳性染色细胞占总细胞数的百分比评分:0分，无阳性染色；1分，阳性细胞<25%；2分，阳性细胞25%～50%；3分，阳性细胞＞50%。细胞质染色强度计分乘以染色阳性细胞占比评分为最终染色评分，<6分为EphA8低表达，≥6分为EphA8高表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。采用Pearsonχ2检验分析EphA8表达与患者临床病理特征的关系，单因素和多因素COX回归模型分析影响预后的相关因素。绘制Kaplan-Meier累积生存率曲线，运用log-rank法比较生存率的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EphA8表达水平与NSCLC临床病理特征的相关性 167例NSCLC肿瘤组织中91例（54.5%）EphA8高表达，EphA8表达水平与肿瘤大小（P<0.001）、TNM分期（P=0.001）、原发肿瘤分级（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.035）有关，而与年龄、性别、吸烟史、分化程度、病理分类及远处转移无相关性。见表1。

表1 EphA8蛋白表达水平与NSCLC患者临床病理学特征的关系 例（%）

2.2 影响NSCLC患者预后的因素分析 单因素Cox回归分析显示，EphA8表达水平（HR=1.474，P=0.030）和肿瘤大小（HR=1.722，P=0.012）是影响NSCLC患者生存率的重要因素。多因素Cox回归模型分析显示，EphA8表达水平（P=0.046）和肿瘤大小（P=0.018）是NSCLC独立的预后因素，EphA8高表达、肿瘤体积大预示NSCLC患者预后不良。见表2。Kaplan-Meier生存曲线显示，EphA8高表达患者5年总生存率低于EphA8低表达患者，肿瘤直径≥3 cm患者5年总生存率低于肿瘤直径<3 cm患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1、图2。

图2 肿瘤大小与NSCLC患者总体生存率分析

表2 EphA8蛋白表达与NSCLC患者预后的关系

图1 EphA8表达与NSCLC患者总生存率分析

3 讨 论

在神经元和血管组织中首次发现的Ephs和Ephrins是受体酪氨酸激酶中最大的家族，Ephs/Ephrins信号通路参与许多重要的生物发育和细胞过程，如轴突引导[7]和血管生成[8]。Ephs/Ephrins几乎在所有类型肿瘤组织中表达，可能通过促进血管化过程来增强肿瘤生长能力[8-9]，其过度表达可阻碍细胞粘附，有利于肿瘤转移[9]。Ephs参与调节细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移[10]，许多Ephs家族成员在转移性癌细胞中的表达水平高于原发肿瘤，其表达水平往往与肿瘤恶性程度和侵袭性有关[11]。EphA1过表达与胃癌的侵袭、转移和不良预后有关[12]，EphA2促进胃癌上皮间质转换[13]，促进结肠癌[14]、前列腺癌[15]发生发展，在胃癌组织中EphA3表达上调，并与肿瘤血管生成和预后相关[16]。

EphA8是Ephs RTKs亚家族的受体之一，通过与GPI锚定的Ephrin-A2、A3和A5结合而发挥作用。EphA8-Fc以caspase依赖方式增加Ephrin-A5表达，从而抑制细胞凋亡[17]。越来越多的研究表明，EphA8是调节肿瘤进展的重要参与者。在胶质瘤中miR-10a靶向下调EphA8 mRNA表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[5]。在舌癌[6]、卵巢癌[7]、结肠癌和胃癌[8]组织中EphA8 mRNA表达上调，促进肿瘤的增殖，侵袭和迁移。对不同肿瘤组织中EphA8表达与临床病理参数相关性分析表明，EphA8可能是一种促癌基因[18]。

本研究选择NSCLC为研究对象，旨在探讨EphA8在NSCLC肿瘤组织中的表达与临床病理特征的相关性以及对患者预后的影响。结果显示，EphA8表达水平与肿瘤大小（P<0.001）、TNM分期（P=0.001）、原发肿瘤分级（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.035）有关。单因素Cox回归分析显示，EphA8表达水平（HR=1.474，P=0.030）和肿瘤大小（HR=1.722，P=0.012）是影响NSCLC患者生存率的重要因素。多因素Cox回归模型分析显示，EphA8表达水平（P=0.046）和肿瘤大小（P=0.018）是NSCLC独立的预后因素。Kaplan-Meier生存曲线显示，EphA8高表达患者5年总生存率低于EphA8低表达患者，肿瘤直径≥3 cm患者5年总生存率低于肿瘤直径<3 cm患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。说明EphA8高表达与NSCLC患者的不良预后有关，与舌癌[4]、卵巢癌[5]、结肠癌和胃癌[6]的研究结果相似。然而，单因素Cox回归分析结果显示TNM分期与预后无相关性，这可能是因为TNM分期的制定基于大样本数据，而本研究样本数较少，所以并没有显著性差异。

综上所述，EphA8可作为监测NSCLC患者预后的潜在生物标志物，有望为精准治疗提供新的策略。但本研究仅限于临床观察，今后需扩大样本量，并深入探讨EphA8在NSCLC中的分子作用机制。