大鼠失神经支配后胫前肌变化的实验研究*

仲晶飞，沈筠恬

（1南通大学杏林学院，江苏 226001；2南通大学江苏省神经再生重点实验室）

周围神经损伤是临床常见病症，患者肢体出现不同程度功能障碍，包括感觉、运动功能丧失、慢性疼痛，严重影响其劳动能力和生活质量。骨骼肌是周围神经的靶器官，其结构和功能的维持需要神经支配和调节。骨骼肌失神经支配后，由于缺失神经营养及自身废用，容易发生肌萎缩，其结构和功能发生很多变化[1-3]。失神经肌萎缩一直是国内外研究的热点和难点，目前临床治疗的主要策略是促进受损神经的修复和再生，延缓骨骼肌萎缩[4-6]，深入了解失神经肌肉萎缩的变化及其机制对建立防治新策略非常重要。

骨骼肌由不同类型肌纤维混合组成，根据生理和功能特性可分为慢肌和快肌[7]。胫前肌系小腿前群肌，以快肌纤维为主，氧化酶活性较低，糖酵解酶活性较高[8]。本研究采用大鼠坐骨神经离断模型，通过超微结构、肌细胞截面积、炎症因子及凋亡因子检测观察胫前肌在失神经支配后的病变过程，为临床防治失神经肌萎缩提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物模型 健康雄性SD大鼠（由南通大学实验动物中心提供）100只，体重180±20 g，随机分为5组，每组20只。使用复合麻醉药腹腔注射麻醉，无菌条件下作左臀部斜切口，钝性分离肌肉。在臀肌间隙显露坐骨神经，距梨状肌下缘0.5 cm处切断并切除坐骨神经1.0 cm。缝合伤口，正常饮食。于术后0、7、14、21和28天取大鼠术侧胫前肌进行后续实验，以0天作为对照。

1.2 大鼠胫前肌肌细胞超微结构观察 显微镜下去除胫前肌中的结缔组织，切成1 mm3小块，每个标本切取4～6个组织块。置入含2.5%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液和1%锇酸中分别固定2小时，梯度乙醇及丙酮脱水，环氧树脂618包埋。超薄切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察胫前肌超微结构。

1.3 大鼠胫前肌肌细胞截面积测量 取术侧胫前肌标本浸入4%多聚甲醛固定，流水冲洗24小时，梯度蔗糖脱水，冰冻切片，厚度12μm，常规苏木精-伊红（HE）染色。10倍显微镜下观察，随机选取6个高倍视野，每个视野计数30个肌细胞，利用Leica Qwin图象分析系统测量肌细胞截面积，取均值。

1.4 IL-6水平测定 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定胫前肌肌组织中IL-6含量。将坐骨神经损伤后不同时间点的胫前肌样品加入ELISA板，室温孵育2小时。洗板，加入生物素化抗IL-6抗体，室温孵育1小时。洗板，加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin，室温避光孵育20分钟，分光光度计在450 nm处读取OD值。

1.5 Western Blot法测定Bcl-2、Bax蛋白表达 提取胫前肌肌组织蛋白，取30μg总蛋白上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2小时，加入抗Bcl-2（1∶500；Abcam）、抗Bax（1∶500；Abcam）和抗β-actin（1∶5 000；Abcam）抗体，4℃孵育过夜。二抗室温孵育1小时后扫描蛋白条带，以β-actin为内参进行分析。

1.6 统计学处理 应用STATA 7.0统计学软件进行数据分析处理。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 失神经支配后胫前肌超微结构 透射电镜下观察，失神经支配后0天时肌细胞结构正常，肌丝排列有序，线粒体未见异常（图1A，封二）；失神经后7天，肌丝排列稍不规则、线粒体形态无明显异常（图1B，封二）；失神经后14至21天，肌丝排列稍不规则，局部萎缩变细，肌间隙增宽，线粒体轻微肿胀，偶见空泡化（图1C、D，封二）；失神经后28天，肌丝排列不规则，线粒体明显肿胀，部分空泡化（图1E，封二）。

图1 失神经支配后不同时间点胫前肌超微结构

2.2 失神经支配后胫前肌肌细胞截面积 与失神经支配后0天比较，失神经后7、14、21和28天胫前肌肌细胞截面积明显降低，差异均有统计学意义（P<0.01），且随着损伤时间延长，肌细胞截面积呈下降趋势，见表1。显微镜下失神经支配后0天时胫前肌肌纤维饱满，分布均匀，肌纤维间隙正常。随着损伤时间的延长，肌细胞排列欠整齐，且大小不均，肌细胞萎缩，直径减小（图2，封二）。

图2 失神经支配后不同时间点胫前肌形态�HE染色�

表1 胫前肌肌细胞截面积 μm2

2.3 失神经支配后胫前肌组织中炎症因子水平 与失神经支配后0天比较，失神经后7、14、21和28天胫前肌肌组织中IL-6含量显著增加，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图3。

图3 失神经支配后不同时间点胫前肌肌组织中IL-6含量

2.4 失神经支配后胫前肌组织中凋亡相关蛋白表达水平 与失神经支配后0天比较，失神经后7、14、21和28天胫前肌组织中Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2/Bax下调，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图4（封二）。

图4 失神经支配后不同时间点胫前肌组织中凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

骨骼肌的结构完整和功能维持受到神经系统的支配和调节，一旦周围神经发生损伤，再生非常缓慢，神经元胞体的再生轴突不能及时刺激距离较远的失神经骨骼肌，肌肉发生相关蛋白和代谢酶活性的改变而逐渐萎缩，患者生活质量明显下降[9-11]。

失神经肌萎缩的典型特征是肌纤维直径减小，蛋白质含量下降。本研究结果显示，失神经支配后1周，胫前肌肌丝排列稍不规则，线粒体形态等无明显异常。随着损伤时间延长，肌丝局部萎缩变细，肌间隙增宽、线粒体发生肿胀，逐渐空泡化，并且肌细胞截面积呈下降趋势。

周围神经损伤后，局部炎症反应吸引周围炎症细胞聚集，促进肌萎缩进程，因此炎症作为影响肌肉组织微环境的重要因素也在骨骼肌萎缩中发挥关键作用[12]。本研究发现，失神经支配后胫前肌肌组织中促炎细胞因子IL-6含量增加，可能与炎症细胞清除萎缩坏死的组织碎片有关。IL-6由巨噬细胞、内皮细胞等分泌，在炎症反应中主要通过调节免疫细胞而发挥作用。有研究报告，注射IL-6可导致骨骼肌萎缩，而抑制IL-6信号传导可阻止失神经支配引起的肌肉萎缩，说明IL-6对失神经支配的骨骼肌萎缩具有重要意义[13]。此外，本研究中失神经支配后胫前肌肌组织中抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调，表明这些凋亡相关蛋白与失神经肌萎缩的发生密切相关。

综上所述，失神经支配后胫前肌形态学和超微结构发生肌萎缩改变，同时肌组织中存在炎症反应，肌细胞凋亡增加，提示失神经支配后肌萎缩是多事件参与的复杂过程，其相关分子机制还有待进一步研究。