QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定鸡蛋中19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留量

谭建林，彭珍华，赵秀琳，马雪涛，张雪媛，刘晓林，胡赠彬，冯 雷

（云南省产品质量监督检验研究院/国家热带农副产品监督检验中心, 云南昆明 650223）

氨基甲酸酯类农药杀虫效果明显，在农业生产中应用广泛[1]，但其对人畜有急性毒性作用，同时农产品中残留氨基甲酸酯类农药对公众危害较大[2-3]。因此，我国和其他许多国家和地区对氨基甲酸酯类农药在食品中的残留制定了限量标准[4-5]，欧盟规定禽蛋中涕灭威的最高残留量为：0.01 mg/kg；灭多威的最高残留量为：0.02 mg/kg；呋线威、丙硫克百威和残杀威的最高残留量为：0.05 mg/kg[3]，而我国GB2763规定了蛋类中丁硫克百威、灭多威、杀线威和霜霉威的最大残留量分别为：0.05、0.02、0.02和0.01 mg/kg，其他氨基甲酸酯类杀虫剂并未作限量要求[4]。

目前我国检测氨基甲酸酯类农药的标准主要有酶抑制法[6-7]、液相色谱-柱后衍生法[8-10]、气相色谱法[11-12]、气相色谱-串联质谱法[13-14]和液相色谱-串联质谱法[15-19]。近年来，一些生产者为了降低鸡的病死率，在生产过程中滥用各种农药和兽药。从欧洲爆出鸡蛋中氟虫腈污染的食品安全事件[20]，使人们对鸡蛋中农兽残的关注日益增加，但是国内目前对鸡蛋中农药残留的研究较少，主要采用气相色谱法[21]。由于氟虫腈事件，关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留的研究和标准相对较多[22-24]，但目前还未有鸡蛋中氨基甲酸酯类农药的检测标准。此外，氨基甲酸酯类农药相关检测标准和应用中的前处理大多采用固相萃取小柱进行净化[8-10,25-26]，前处理成本高、耗时长、步骤繁琐，运用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged and safe）方法对提取液进行净化，操作简单、效率高。本研究建立了同时测定鸡蛋中的19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留量的快速分析方法，为蛋类样品中农残标准的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 本地农贸市场采购（每批采购数量：1 kg）；乙腈 色谱纯，德国默克集团；氯化钠 分析纯，四川西陇化工有限公司；甲酸铵 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；标准品（100 μg/mL）：19种氨基甲酸酯类农药（二氧威、恶虫威、残杀威、乙硫苯威、仲丁威、甲硫威、猛杀威、农虫威、甲萘威、灭多威、茚虫威、抗蚜威、乙霉威、霜霉威、丁硫克百威、异丙威、杀线威、克百威（3-羟基克百威）、涕灭威（涕灭威砜、涕灭威亚砜）） 坛墨质检科技股份有限公司。

LC-MS 8050串联质谱仪 日本岛津公司；0.1 mg和0.01 mg分析天平 瑞士梅特勒公司；TGL-20B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；Milli-Q超纯水仪 德国默克化工技术有限公司；KQ-800DE超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；VORTEX2涡旋振荡器 德国IKA集团；Research® plus 20～200 μL、10～1000 μL移液枪 德国 Eppendorf 公司；PSA/C18净化管（100 mg/100 mg） 上海安谱实验科技股份有限公司；C18E小柱（500 mg/6 mL） 月旭科技（上海）股份有限公司；HLB小柱（200 mg/3 mL） 岛津（上海）实验器材有限公司；NH2小柱（200 mg/3 mL） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 取1 kg鸡蛋去壳后混合均匀（GB 2763 附录A），称取2 g试样至50 mL 离心管，加入2 g氯化钠和10 mL乙腈，涡旋2 min，冰浴冷却，8000 r/min条件下离心10 min，取1.0 mL上清液到PSA/C18净化管中，涡旋1 min，静置5 min，取上清液过0.22 μm有机微孔滤膜至样品瓶中，待测定。

1.2.2 标准溶液配制 标准储备液：准确移取各氨基甲酸酯类农药标准品（100 μg/mL）1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱保存。

混合标准溶液：分别准确移取各氨基甲酸酯类农药标准储备液1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成400 ng/mL的混合标准溶液，于-18 ℃冰箱保存。

标准工作溶液：准确移取适量混合标准溶液，用乙腈稀释，配制成浓度为0.2、1、5、10、20和50 ng/mL的混合标准工作溶液。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件 采用Penomenex Kinetex 1.7 μ XB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；柱温40 ℃；样品温度8 ℃；流动相A：10 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈；流速0.4 mL/min；进样量5 μL。梯度洗脱程序：0 min，流动相B：25%；0～2.8 min，流动相B：25%～95%；2.8～4.0 min，流动相B：95%～95%；4.1～6.0 min，流动相B：25%～25%。

1.2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）：多反应监测（MRM），雾化气流量：2.8 L/min；加热气和干燥气流量：10 L/min；接口温度：300 ℃；DL温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃，接口电压：4.0 kV；碰撞气为氩气。定量离子对和定性离子对见表1（定量及定性方法参考欧盟《食品饲料中农残分析的质量控制和方法确认的指导文件SANTE/11945/2015》）。

表1 化合物的离子对、线性方程、相关系数、回收率、相对标准偏差（n=6）、检出限和基质效应Table 1 Ion pair, linear equations, correlation coefficients, recoveries, relative standard deviations （RSDs）, LOD and ME for analytes （n=6）

1.3 数据处理

所有数据均在岛津公司的LabSolutions Version 5.89软件下进行采集以及对数据结果定量和定性分析，相对标准偏差实验重复为6次。采用Execl 2010进行数据统计和表格制作。

2 结果与讨论

2.1 流动相选择

一般来说，采用串联质谱法分析氨基甲酸酯类农药的流动相为0.1%甲酸水溶液/乙腈[15-17]，电喷雾离子源正离子模式下在流动相中加入一定量的甲酸、甲酸铵、乙酸铵等，可以增加目标离子的离子化状态，提高目标物离子化效率，改善峰形，提高分离度。本实验分别采用A组：0.1%甲酸水溶液/乙腈、B组：5 mmol/L乙酸铵水溶液/乙腈和C组：0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵溶液/乙腈作为流动相进行分析。如图1所示，以5 mmol/L乙酸铵水溶液/乙腈分析时，与0.1%甲酸水溶液/乙腈相比较，除霜霉威外的其他氨基甲酸酯类农药的出峰时间均缩短，灵敏度也在一定程度上提高，但霜霉威存在严重拖尾情况，这表明甲酸铵的加入可提高氨基甲酸酯类农药的灵敏度，为解决霜霉威的拖尾现象，在甲酸铵溶液中加入0.1%甲酸，很好的解决了该现象，最终以0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵溶液/乙腈作为流动相进行分析时，19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物的响应相对是最高的，峰形最优，无拖尾情况，因而采用C组作为流动相。

图1 流动相选择Fig.1 Mobile phase selection

2.2 净化小柱选择

本研究检测的农药在结构上有一定的相似性，但是极性相差很大，对净化小柱的选择尤为重要。HLB小柱对碱性化合物具有高的选择性和灵敏度；NH2小柱可以有效去除样品中的磺酸根离子等强阴离子和糖类等高极性有机化合物；PSA吸附剂对脂肪酸结构化合物具有较强的吸附作用；C18可以去除非极性化合物。本实验采用四种不同类型填料的小柱分别进行净化，四种净化小柱分别为：C18E小柱、HLB小柱、NH2小柱和C18/PSA净化管。空白鸡蛋样品先加入1 mL的混合标准溶液（1 μg/mL），经1.2.1方法处理，提取完成后分别取2 mL用四种净化小柱进行净化（使用前活化），以目标物回收率为评价指标比较不同的净化效果，结果如图2所示。对于氨基甲酸酯类农药来说，C18E小柱回收率最差（回收率为23.6%～67.2%，最低为霜霉威：23.6%，最高为残杀威：67.2%），其次是HLB小柱（回收率为53.2%～111.0%，最低为棉铃威：53.2%，最高为霜霉威：111.0%），NH2小柱和C18/PSA净化管获得的回收率较好（NH2小柱回收率为：63.8%～126.2%，最低为棉铃威：63.8%，最高为霜霉威：126.2%；C18/PSA净化管小柱回收率为：66.5%～110.9%，最低为异丙威：66.5%，最高为丁硫克百威：110.9%），22种化合物，NH2小柱对其中3种农药残留回收率最高，C18/PSA对其中18种农药残留回收率最高，相对于其他的三种净化方式，C18/PSA净化效果好、回收率高，且操作简单、前处理效率高，适合大批量的样品检测，同时可以有效吸附鸡蛋中脂肪等杂质。因此选用C18/PSA净化管作为鸡蛋中氨基甲酸酯类农药检测的净化方式。

图2 四种净化小柱对目标物回收率的影响Fig.2 Effect of four kinds of purification columns on the recovery of target materials

2.3 基质效应

基质效应（ME：Matrix Effect）指样品中其他成分对目标待测物测定值的影响，即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰[24]。本实验采用乙腈对鸡蛋进行提取，提取液中可能含有大量的脂肪、蛋白质、色素等物质，均可能产生基质效应。采用提取后添加的方法，通过比较以乙腈为溶剂和空白提取溶液为溶剂，分别配制0.2、1、5、10、20、50 ng/mL的系列标准工作溶液，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。比较乙腈溶剂与基质标准曲线的斜率，评估鸡蛋的基质效应。基质效应（%）=（空白基质标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率×100[27-28]。ME值如果是正，则是正效应，基质可提高目标物效应，ME值如果是负，则是负效应，基质可降低目标物效应。基质效应 按 其 绝 值|ME|分 为3个 等 级[29-30]：0%＜|ME|≤20%，是弱基质效应；20%＜|ME|≤50%，是中等强度基质效应；|ME|＞50%，是强基质效应。从表1中可以看出，鸡蛋样品不同的氨基甲酸酯类农药，基质效应是不同的，22种化合物，4种ME＞0，18种ME＜0，全部为弱基质效应（0%＜|ME|≤20%）。因此，本实验无需使用样品基质来配制基质标准工作曲线，有效的节约成本和缩短前处理时间。

2.4 方法评价

采用1.2.3仪器条件对0.2～50 ng/mL的氨基甲酸酯类农药混合标准溶液进行测定，由表1可见，各标准曲线相关系数（R2）均大于0.999，结果说明了本实验的检测方法在其线性范围内的线性相关性良好。标准物质色谱图见图3，图中峰号所对应农药名称见表1。

图3 19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物色谱图Fig.3 Chromatogram of 19 carbamate pesticides and metabolites residues

方法检出限是依据1.2.2操作步骤，制备不含目标氨基甲酸酯类农药的空白基质样品提取液，逐级稀释氨基甲酸酯类农药混合标准溶液，当定量离子对和定性离子对的信噪比为3时所对应的含量为检出限。19种氨基甲酸酯类农药因其理化性质不同，在色谱柱上保留时间和质谱上离子化效率不同，猛杀威、抗蚜威、霜霉威、丁硫克百威和克百威响应相对较好，检出限较低；其余氨基甲酸酯类农药离子化效率相对较小，因此检出限也较高。19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物的检出限结果见表1。

选取阴性的典型样品，向试样中添加氨基甲酸酯类农药混合标准溶液，分别进行10、20、50 μg/kg（农虫威检出限、2倍农虫威检出限和5倍农虫威检出限）的加标回收实验，每份样品检测6次，实验结果见表1。实验结果表明本方法的回收率为69.3%～107.6%，相对标准偏差小于9.21%。说明该方法对鸡蛋中19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物的测定，具有良好的准确度和精密度，符合农药残留分析的要求。

2.5 样品测定结果

采用本检验方法对市场上采购的20批鸡蛋进行19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留检测，以保留时间、定性离子对和离子对丰度比进行定性分析，以定量离子对进行定量分析。20批鸡蛋样品均未检出19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留。

3 结论

本方法用乙腈进行提取，采用QuEChERS方式进行净化，优化了流动相和净化小柱，考察了不同的净化方式和鸡蛋样品的基质效应，建立了鸡蛋中19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法前处理过程快速简单，能实现大批量样品的快速处理，方法的检出限、精密度、稳定性和线性关系均满足19种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留的分析检测要求。