基于HPLC-MS/MS对枇杷叶水提组分分析及萜类物质的结构鉴定

李佳美，徐 伟, ，张 雪，邵百琪，谢红瑶，吴 凡，马智宇，陈 华

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院, 黑龙江哈尔滨 150076；2.南通市天籁村农业科技发展有限公司, 江苏海门 226100）

枇杷叶又名巴叶，为蔷薇科植物枇杷（Eriobobotryae japonica（Thunb.） Lindl.）的干燥叶片[1]。我国是世界上最大的枇杷生产国，枇杷树是四季均枝繁叶茂的树种，尤其初冬花芽分化前，对枇杷树进行剪修会产生大量的枇杷叶。枇杷叶富含萜类、挥发油类、黄酮类、多酚类、有机酸类以及皂苷类等物质[2]。萜类是枇杷叶组织中的次生代谢物质，根据含有的异戊二烯单位数目的不同，可分为单萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜等[3]。枇杷中主要含有的是由6个异戊二烯单位组成的熊果烷型、齐墩果烷型的五环三萜类，目前从枇杷叶中分离出的主要三萜类物质有：熊果酸、科罗索酸、委陵菜酸、齐墩果酸、山楂酸、桦木酸等[4-5]。

据《中国药典》记载，药用枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸总含量大于0.70%[6]。叶广亿等[7]研究发现蜜炙枇杷叶水提物平喘效果明显优于醇提物。张娜等[8]研究了枇杷叶水提物的祛痰、止咳及抗炎作用，发现枇杷叶水提取物剂量为0.8～3.2 g/kg时有止咳活性。WU等[9]发现枇杷叶的水提物和醇提物均具有镇咳祛痰作用，且黄酮含量较高的枇杷叶水提物具有较强的祛痰活性，而三萜含量较高的枇杷叶醇提物具有较强的镇咳活性。HPLC-MS/MS在植物药物分析领域被广泛应用，不仅具有色谱的高效分离能力，同时还能得到化合物的分子量以及离子碎片等信息，可快速确定化合物的结构[10]。

2014年国家卫健委发布关于批准枇杷叶等9种新食品原料的公告（2014年第20号），为枇杷叶用于食品加工原料提供了依据，但目前国内外关于枇杷叶的研究主要集中在药用成分的醇提物上，水溶性活性物质研究报道较少。本课题采用HPLC-MS/MS技术，确定枇杷叶水提组分中化合物的成分，并进一步对萜类化合物进行结构鉴定，为枇杷叶水提成分的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枇杷叶（2019年9～11月份） 采自江苏省海门市枇杷园；纤维素酶 （ 1×104U/g ） 东恒华道生物科技有限公司；漆酶（1×105U/g） 河北仟盛生物科技有限公司；二氯苯丙氨酸 阿拉丁试剂公司；甲醇、乙腈 LC-MS级，Merck KGaA；甲酸 LC-MS级，山东西亚化学工业有限公司。

HX-MC-1实验室微波合成仪 Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色谱仪、Q-Exactive HF高分辨质谱仪 Thermo Fisher Scientific；Zorbax Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱Agilent Technologies。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 阴干枇杷叶粉碎过10目筛，置于洁净的三角瓶中加入1%纤维素酶和1%漆酶，按水料比20:1 mL/g加入蒸馏水并将其搅拌均匀，置于微波反应装置中，微波提取条件为：微波功率500 W，微波时间15 min，微波温度50 ℃。将提取液过滤后进行旋转蒸发浓缩，浓缩至原体积的1/5，旋转蒸发仪设置真空度为-0.085 MPa，水浴温度为60 ℃，转速120 r/min[11]。

取2 mL枇杷叶水提组分于5 mL离心管中，加入1.5 mL的70%甲醇，涡旋1 min，室温超声提取10 min（温度：50 ℃，功率200 W），于4 ℃冰箱冷藏浸提过夜，加入10 μL浓度为100 μg/mL的内标溶液二氯苯丙氨酸，使样品溶液中内标浓度为1 μg/mL。之后4 ℃，5000 r/min离心5 min，取出上清液，根据物质内含物含量进行稀释，过膜上机。

1.2.2 液质条件 色谱条件：仪器分析平台：LCMS（Thermo, Ultimate 3000LC, Q Exactive HF）；色谱柱：C18色谱柱（Zorbax Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm））；色谱分离条件为：柱温为30 ℃；流速0.3 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：纯乙腈；进样量为2 μL，自动进样器温度4 ℃；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱流动相条件Table 1 Mobile phase conditions of liquid chromatography

质谱条件：正离子模式下加热器温度325 ℃；鞘气流速：45 Arb；辅助气流速：15 Arb；吹扫气流速：1 Arb；电喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：330 ℃；SLens RF Level：55%。负例子模式下加热器温度325 ℃；鞘气流速：45 Arb；辅助气流速：15 Arb；吹扫气流速：1 Arb；电喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。

扫描模式：一级全扫描（Full Scan, m/z 100～1500）与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2, TopN =10）；分辨率：120000（一级质谱）& 60000（二级质谱）。碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD）。

1.3 数据处理

质谱数据通过Xcalibur 2.0 for DSQ II软件处理，结合质谱数据库信息注释和分类，再参考文献报道和 PubChem，MassBank等数据库中相同成分的碎片离子信息进行匹配分析，推测化学成分裂解规律。

2 结果与分析

2.1 枇杷叶水提组分总离子流测定结果

利用HPLC-MS/MS技术对枇杷叶水提组分在正、负离子模式下进行分析，得到的总离子流图（TIC）如图1、图2所示，共检测到120个化合物，本研究针对枇杷叶水提组分中的萜类化合物进行结构解析。包括18种萜类化合物，总相对含量1452.693 μg/mL；24种黄酮类化合物，总相对含量10378.081 μg/mL；18种酚类化合物，总相对含量36967.955 μg/mL；5种香豆素类化合物，总相对含量214.778 μg/mL；还包括16种挥发性物质、10种氨基酸、11种有机酸类和18种其他化合物。

图1 枇杷叶水提组分正离子流图Fig.1 Positive ion flow diagram of the water-extracted components of loquat leaves

图2 枇杷叶水提组分负离子流图Fig.2 Negative ion flow diagram of water-extracted components of loquat leaves

2.1.1 枇杷叶水提组分中黄酮类化合物种类及含量从枇杷叶水提组分中检测到24种黄酮类化合物，总相对含量10378.081 μg/mL。主要包括黄酮醇类16种：槲皮素（112.970 μg/mL）、槲皮苷（25.693 μg/mL）、异槲皮苷（885.100 μg/mL）、二氢槲皮素（5.206 μg/mL）、芦丁（1273.691 μg/mL）、山奈酚（55.994 μg/mL）、二氢山奈酚（1.502 μg/mL）、金丝桃苷（22.906 μg/mL）、异鼠李素（0.537 μg/mL）、阿福豆苷（1867.205 μg/mL）、山奈酚-7-O-B-D-葡萄糖苷（13.435 μg/mL）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（12.804 μg/mL）、槲皮素-3,4'-二-O-葡糖苷（957.863 μg/mL）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（7.060 μg/mL）、萹蓄苷（槲皮素-3-O-A-L-吡喃阿拉伯糖苷）（1.704 μg/mL）、花旗松素-3-O-A-L-吡喃鼠李糖苷（440.546 μg/mL）；黄烷醇类4种：表儿茶素（83.833 μg/mL）、儿茶素（1330.307 μg/mL）、原花青素B1（2355.336 μg/mL）、原 花 青 素C1（666.048 μg/mL）；异黄酮类1种：葛根素（157.034 μg/mL）；黄酮类2种：木犀草素（47.249 μg/mL）、圣草酚（2.667 μg/mL）；二氢查尔酮1种：根皮苷（51.391 μg/mL）。

其中异鼠李素、异槲皮苷、芦丁、葛根素等均为枇杷叶主要功效成分。异鼠李素具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗高血压等作用；霍宇航等[12]对“大五星”枇杷叶中主要成分进行分析，发现异槲皮苷和芦丁含量分别为8.08、3.86 mg/100 g，芦丁作为枇杷叶中最主要的黄酮类物质，具有治疗毛细血管的脆性、降胆固醇、糖尿病等作用；葛根素是一种异黄酮类物质，主要具有解酒毒、心肌保护等作用。

2.1.2 枇杷叶水提组分中酚类化合物种类及含量枇杷叶水提组分种检测到18种多酚类化合物，总相对含量36967.955 μg/mL。主要包括羟基苯甲酸类5种：原儿茶酸（1.400 μg/mL）、没食子酸（16.304 μg/mL）、4-甲氧基水杨酸（2.497 μg/mL）、龙胆酸（183.657 μg/mL）、高龙胆酸（56.682 μg/mL）；羟基肉桂酸类13种：咖啡酸（1.889 μg/mL）、绿原酸（219.009 μg/mL）、新绿原酸（5067.336 μg/mL）、绿原酸甲酯（31.764 μg/mL）、4-香豆酸（45.482 μg/mL）、右旋奎宁 酸（23875.628 μg/mL）、3-O-阿 魏 酰 奎 尼 酸（531.482 μg/mL）、2-羟基肉桂酸（15.804 μg/mL）、Caffeic acid hexoside（40.490 μg/mL）、Coumaroyl Hexoside（395.100 μg/mL）、Coumaroyl quinic acid（6386.499 μg/mL）、osmanthuside H（93.410 μg/mL）、反-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂（3.468 μg/mL）。

2.1.3 枇杷叶水提组分香豆素类化合物种类及含量5种香豆素类化合物，总相对含量214.778 μg/mL。香豆素（3.633 μg/mL）、5，7-二羟基-4-甲基香豆素（2.466 μg/mL）、羟甲香豆素（5.982 μg/mL）、7-羟基香豆素（198.719 μg/mL）、7-甲氧基香豆素（3.978 μg/mL）。香豆素类化合物常存在于白芷中，在枇杷叶水提物中首次被发现。袁园等[13]采用微波辅助法提取白芷中香豆素类成分发现其含量为11.94 mg/g。香豆素类物质具有重要生理活性：如防止凝血、抑制病毒、清除自由基、抗氧化和抗衰老等活性。

2.1.4 枇杷叶水提组分中挥发类及其他类物质 枇杷叶水提组分中还检测到16种挥发性物质包括：大茴香醛（茴芹和山楂香气）、茉莉酸甲酯（红茶主体香气）、环己基（苯基）甲醇、异佛尔酮（樟脑气味）、麝香酮、对羟基苯甲醛、邻苯二甲醛、3,4-二羟基苯甲醛、对羟基安息香醛、麦芽醇、4-吲哚甲醛、吲哚（茉莉花香）、4-羟基-3-甲氧基苯乙酮、苯乙酮（甜味）、呋喃酮（强烈的焦糖香气，同时具有浓郁的水果香味及果酱味，稀释后具有复盆子香味）、花椒油素。其中枇杷叶水提组分中麦芽醇含量最高为65.21 μg/mL，为主体呈香物质，具有草莓香气。

此外，枇杷叶水提组分中还检测到有机酸类11种，包括4-茴香酸、1-丁烯-2,3,4-三羧酸、柠檬酸、1-氨基环己烷羧酸、己二酸、壬二酸、α-桐酸、亚麻酸、2-羟基戊二酸、莽草酸、曲酸；氨基酸类10种，包括D-（+）-脯氨酸、谷氨酸、L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、2-羟基苯丙氨酸、N-果糖基异亮氨酸、2-哌啶甲酸；核苷类：鸟嘌呤、腺嘌呤；一种双环单萘酮类：D-（+）-樟脑；一种柠檬苦素类物质：梣酮；生物碱3种：巴豆苷、甜菜碱、当归碱；维生素类3种：泛酸、烟酸（维生素B3）、吡哆醇（维生素B6）。

2.2 萜类化合物的结构鉴定

再根据化合物的二级质谱信息，通过数据库、分子量、质谱碎片、裂解规律、结合文献信息等进行对比，进一步鉴定出了水提组分中18种萜类化合物的结构。萜类化合物的鉴定结果、质谱数据等信息见表2。18个萜类化合物，主要包括乌苏烷型6种：化合物6、10、11、12、14、15；齐墩果烷型7种：7、8、9、13、16、17、18；3种倍半萜类物质：化合物3，4，5；1种二萜类物质：化合物2；1种特殊的环烯醚萜苷：化合物1。化学结构式如图3所示。

表2 枇杷叶水提组分中萜类物质的UPLC-MS /MS成分检测鉴定结果Table 2 UPLC-MS/MS component detection and identification results of terpenoids in the water-extracted components of loquat leaves

图3 枇杷叶水提组分中萜类化学成分结构式Fig.3 Structural formula of terpenoids in water extract of loquat leaves

根据化合物的保留时间和质谱数据，对化合物进行了鉴定。三萜皂苷类成分，在质谱中发生高能碰撞，容易脱去葡萄糖基，而对于三萜酸类成分容易失去H2O、CO等中性基团[21]。

化合物1，在正离子模式下的一级质谱为m/z 405.1408[M-H]-，提示其分子量为 406.1482。二级质谱中出现明显的碎片离子峰243.4643，是（M-H）-脱去一个葡萄糖基后的特征碎片峰（M-H-Glu）－。基于质谱数据、并结合文献数据[22]比较分析最终鉴定化合物1为山栀苷甲酯，其二级质谱图和裂解途径解析如图4所示。山栀苷甲酯在以往的枇杷叶活性物质中未见报道，是一种特殊的环烯醚萜类，具有镇痛、抗炎和止血等功效[23]，这与枇杷叶主要功能相吻合。化合物2，其在正离子模式下的一级质谱为m/z 425.1422 [M+H]+，提示其分子量为 424.1349。二级质谱中出现明显的碎片离子峰407.1098和365.0654，分别是（M+H）+脱去一分子水后的特征碎片峰（M+H-H2O）+和（M+H-H2O-H2-CO2）+基于质谱数据，并结合文献数据[15-16]比较分析最终鉴定化合物2为银杏内酯B，其二级质谱图和裂解途径解析如图5所示。

图4 山栀苷甲酯二级质谱图及裂解途径Fig.4 MS spectrum and cleavage pathway of kaempferol methyl ester

图5 银杏内酯B二级质谱图及裂解途径Fig.5 Ginkgolide B secondary mass spectrum and its cleavage pathway

银杏内酯B是一种二萜内酯，为银杏叶的主要活性物质，在以往的枇杷叶活性物质中未见报道，是有效的血小板激活因子拮抗剂，被广泛应用于心脑血管疾病[15]。

化合物4，在正离子模式下的一级质谱为m/z 221.1906 [M+H]+，提示其分子量为 220.1830。二级质谱中出现明显的碎片离子峰203.1797，是（M+H）+脱去一分子水后的特征碎片峰（M+H-H2O）+。基于质谱数据、并结合文献数据比较分析最终鉴定化合物4为石竹素。化合物5，在正离子模式下的一级质谱为m/z 205.1952 [M+H]+，提示其分子量为204.1880。二级质谱中出现明显的碎片离子峰149.1327，是（M+H）+脱 去C4H8的 特 征 碎 片 峰（M+H-C4H8）+。基于质谱数据、并结合文献数据[17]比较分析最终鉴定化合物5为Prespatane。

以化合物12为例，其在负离子模式下的一级质谱为m/z 487.3439[M-H]-，提示其分子量为 488.3511，二级质谱中现明显的碎片离子峰487.3437。基于质谱数据、色谱tR、并结合文献数据[18]比较分析最终鉴定化合物12为积雪草酸，其二级质谱图和裂解途径解析如图6所示。化合物14、15、11、6、10、18、8、7、16、13结构与积雪草酸类似，皆为五环三萜类，有相似的质谱裂解规律，此处不再赘述，推测为熊果酸、科罗索酸、（1α,2α,3β,5ξ,9ξ,18ξ）-1,2,3,19-Tetrahydroxyurs-12-en-28-oicacid（熊果酸衍生物）、（3β,5ξ,9ξ）-3,6,19-Trihydroxyurs-12-en-28-oic acid（熊果酸衍生物）、3,19-Dihydroxyurs-12-ene-23,28-dioic acid（熊果酸衍生物）、齐墩果酸、三羟基齐墩果酸、光甘草内酯、18β-甘草次酸、（3β,5ξ,9ξ）-3,23-Dihydroxy-1-oxoolean-12-en-28-oic acid（齐墩果酸衍生物）。

图6 积雪草酸二级质谱图及裂解途径Fig.6 Asiatic acid secondary mass spectrum and its cleavage pathway

熊果酸及其衍生物、齐墩果酸及其衍生物均为枇杷叶主要功能成分，具有抗炎、降血糖等功效。莫颖华等[24]采用醇回流法提取枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸总量为8.21 μg/mL，本实验检测到水提枇杷叶组分中熊果酸和齐墩果酸总量为16.51 μg/mL；与以往报道相比，积雪草酸、光甘草内酯、18β-甘草次酸为首次在枇杷叶中发现。积雪草酸来源于积雪草，李伊莎等[25]采用HPLC法检测醇提法提取积雪草中积雪草酸含量为1.155 g/kg，本实验检测到水提枇杷叶组分中积雪草酸含量为220.031 μg/mL。据报道，积雪草酸具有治疗皮肤创伤、抗抑郁、抗阿尔茨海默病、修复神经损伤等多种药理作用[26]。光甘草内酯和18β-甘草次酸是甘草的特征性成分，PELLATTI等[27]发现，18β-甘草次酸是持续外阴阴道念珠菌病局部治疗的一种有前途的生物成分；且对引起呼吸道感染的病毒有体外抗病毒作用，如流感病毒和严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒。

化合物17，其在正离子模式下的一级质谱为m/z 441.3134 [M+H]+，提示其分子量为 440.3659。二级质谱中出现明显的碎片离子峰423.3627和395.3679，是（M+H）+脱去一分子水后和CO的特征碎片峰（M+H-H2O）+、（M+H-H2O-CO）+，基于质谱数据、色谱tR、并结合文献数据[19-20]比较分析最终鉴定化合物17为栎瘿酸，其二级质谱图和裂解途径解析如图7所示。

图7 栎瘿酸二级质谱图及裂解途径Fig.7 Quercus acid secondary mass spectrum and cleavage pathway

栎瘿酸为A环开裂的五环三萜类化合物，常从大叶秦艽的脂溶性成分中被分离出来[28]，陈玉芬等[29]发现栎瘿酸可使被动皮肤过敏反应小鼠耳朵的染色变浅、肿胀程度减轻，具有体内抗炎活性。

3 结论

利用高效液相色谱-质谱对提枇杷叶水提组分进行分析检测及主要成分的结构鉴定，正、负离子模式下水提组分中共检测到120个化合物。包括18种萜类化合物，总相对含量1452.693 μg/mL；24种黄酮类化合物，总相对含量10378.081 μg/mL；18种酚类化合物、总相对含量36967.955 μg/mL；5种香豆素类化合物，总相对含量214.778 μg/mL；通过数据库、分子量、质谱碎片、裂解规律、结合文献信息等进行对比，鉴定出18种萜类化合物的结构，主要包括乌苏烷型6种、齐墩果烷型6种、3种倍半萜、1种二萜类物质和1种特殊的环烯醚萜苷类物质。与以报道的枇杷叶萜类物质相比，栎瘿酸、银杏内酯B、Prespatane、山栀苷甲酯、Icariside B5、皂皮酸、积雪草酸、18β-甘草次酸。本研究为全面解析枇杷叶水提组分提供参考，为枇杷叶水提物应用于功能食品开发研究提供依据。