芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油热氧化稳定性的影响

崔素萍，穆秋霞，曲柳青，李 琳,2，陈 丹,3，郑喜群,

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院, 黑龙江大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心, 黑龙江大庆 163319；3.国家杂粮工程技术研究中心, 黑龙江大庆 163319）

食品在加工、贮藏及运输过程中，易发生氧化反应，导致食品腐烂变质，甚至危害人体健康，使用抗氧化剂是避免食品氧化变质的方法之一。食品中常用的抗氧化剂有天然来源和人工合成两大类。研究发现，长期使用合成抗氧化剂可能会引起人体退行性疾病的发生[1]。以天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂是食品产业日后发展的必经之路。天然抗氧化剂的研究已成为食品科学发展的新趋势，用酶水解动植物蛋白制得的抗氧化肽是天然抗氧化剂的一种，具有无毒、安全、抗氧化效果好的特点[2]。近年来，科研工作者筛选出了一些具有较高抗氧化活性的抗氧化肽[3-9]，已用于食品、药品抗氧化剂的开发[10-13]。有关抗氧化肽在食品中的应用也受到了广泛关注，并取得了一定的效果[14-16]。如向香肠内添加2%的玉米肽可以延长香肠的保质期，并且肉的颜色不受影响[17]；乳清蛋白抗氧化肽组分、大豆蛋白抗氧化肽组分、鸡蛋黄蛋白抗氧化肽组分、马铃薯蛋白抗氧化肽组分等对肉制品都有良好的抗氧化效果[18-21]；还有研究表明，苋菜蛋白抗氧化肽组分在葵花油、菜籽油热氧化过程中具有抗氧化作用，同时可以延缓重组鱼产品的脂类物质氧化进程[22]。

芸豆具有成熟快、对种植的土壤和水质要求不高、适合在温度较低的地区生长等优点，已成为重要的经济作物。黑龙江省是芸豆的优势产区，年出口芸豆25万吨，产量占全国出口量的1/2。英国红芸豆因其具有籽粒大、色泽鲜艳、营养价值高等特点，颇受市场欢迎。其蛋白质含量为24%左右，高于其它芸豆品种，但因甲硫氨酸、色氨酸是其限制性氨基酸，导致蛋白质的营养价值较低，限制了其作为营养蛋白的应用。目前，英国红芸豆主要用于制作传统副食品包括糕点、豆馅、豆沙等，有关英国红芸豆蛋白的相关深加工产品较少。为了提高英国红芸豆产品的经济效益，可以利用英国红芸豆蛋白，制备高价值的抗氧化活性肽。曲柳青等[23]利用差示热量扫描技术，评价了英囯红芸豆蛋白抗氧化组分（相对分子质量＜1000 U，1000～3000 U，3000～5000 U）在植物油热诱导中的抗氧化作用。 研究结果表明，三种相对分子质量组分均具有抗氧化作用，其中相对分子质量为1000～3000 U的组分抗氧化活性最强。

在实验室水平上抗氧化肽已经展示了作为食品抗氧化剂的潜力，但仅有少量研究评价了抗氧化肽在真实食品基质中的作用[24]。由于食品是一个非常复杂的物质系统，在食品的加工、运输和储藏过程中将发生许多复杂的变化，因此为了分析和综合有一个清晰的背景，通常采用一个简化的、模拟的食品物质系统来进行实验。大豆油是比较简单的食品体系，主要成分是三酰甘油，并富含80%以上的多不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸的稳定性相对较差，易发生缓慢氧化，因此，大豆油是研究抗氧化作用比较理想的食品体系。

为了提高芸豆的经济效益，开发高附加值的芸豆蛋白功能性产品，团队在前期研究工作中，利用碱性蛋白酶及超滤方法制备了具有体外抗氧化活性的英国红芸豆蛋白抗氧化肽（BRKBPAPC）[25-26]；利用差示热量扫描法，间接评价了BRKBPAPC在热诱导的大豆油中的抗氧化作用[23]。本研究拟将BRKBPAPC添加到大豆油中，用Schaal烘箱法63 ℃加速氧化15 d，研究BRKBPAPC在大豆油中的抗氧化作用及对大豆油热稳定性的影响，为BRKBPAPC在食品体系的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分（分子质量＜1000 Da，1000～3000 Da，3000～5000 Da，5000～10000 Da，纯度为95%） 由团队在前期制备；大豆油（精炼一级非转基因大豆油） 嘉里粮油有限公司；维生素E合肥博美生物有限公司；吐温20 食品级，广东润华化工有限公司；羟自由基测试试剂盒 南京建成生物工程研究所；枯草芽孢杆菌发酵生产的碱性蛋白酶（2.0×105U/g） 北京鑫泽天佑生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

CHRISTALPha型冷冻干燥机 德国Marin Christ公司；SPECORD®200PLUS紫外可见分光光度计 德国耶拿分析仪器开发有限公司；202-00A型电热烘箱 天津市赛得利斯实验分析仪器厂；HX-4GM型无菌均质机 上海沪析实业有限公司；LGR10台式高速离心机 上海试验仪器总厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 英国红芸豆蛋白抗氧化肽（BRKBPAPC）组分制备方法见参考文献[23]，以总抗氧化能力为指标，用碱性蛋白酶在最佳酶解条件下（蛋白质质量浓度为5%，pH为10，时间2 h，温度55 ℃，加酶量4 000 U/mL），对英国红芸豆蛋白质进行水解，然后，将酶解液通过5、3及1 kDa的超滤膜进行超滤后，分别冷冻干燥备用。

1.2.2 样品的分组 BRKBPAPC对大豆油热氧化稳定性影响的样品组成见表1。

表1 样品组成及编号Table 1 Sample composition and number

1.2.3 芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油热氧化稳定性的影响 稳定性评价指标见1.2.4中所列指标。BRKBPAPC、吐温20、VE的添加量均为10 mg/mL，以SO-Tw做对照组，SO做空白组，SO-VE为阳性对照。样品在21500 r/min，36 MPa的条件下均质2 min后，用Schaal烘箱法（63±1）℃加速氧化15 d。样品配制完成时为0 d，放入烘箱后，每 d搅拌1次，每3 d取1次样。每个样品做3次重复，取平均值。

1.2.4 指标测定 大豆油的过氧化值（POV）、酸价（Acid Value，AV）、P-茴香胺值、羰基价的测定分别按GB 5009.227-2016《食品中过氧化值的测定》、GB 5009.229-2016《食品中酸价的测定》、GB/T 24304-2009《动植物油脂茴香胺值的测定方法》、GB 5009.37-2003《食用植物油卫生标准的分析方法》方法进行。

1.2.5 添加抗氧化肽的大豆油氧化反应活化能的计算 将抗氧化效果最佳的分子量小于1000 Da的抗氧化肽组分按照2%的添加量加入大豆油中，分别置于65、85、105 ℃温度下30 d,每3 d取样测定过氧化值。为了确定添加抗氧化肽大豆油氧化反应的动力学方程，本研究分别用零级反应动力学方程c=-kt+c0和一级反应动力学方程c=c0.e-kt，对大豆油在不同温度下贮藏过程中的POV值进行拟合，得到相关系数和回归方程，求得反应速率常数k。根据Arrhenius经 验 公 式（lnk=lnk0-Ea/RT），用lnk对1/T作图，得到一条斜率为-Ea/R的直线，由斜率求得表观活化能Ea。

1.3 数据处理

所获得的数据均为三次重复的平均值，采用Statistix 8进行数据分析，数据表现形式为平均值±标准误差（SD）；通过Turkey HSD进行多重比较分析，显著性差异（P＜0.05）；采用Excel 6.0绘图。

2 结果与分析

2.1 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油过氧化值（POV）的影响

POV是指1 kg油脂中所含氢过氧化物的毫摩尔数，是评价油脂初期氧化程度的指标。一般情况下，油脂中出现氢过氧化物，就意味着油脂开始酸败。氧化初期的氢过氧化物含量越髙，酸败程度越大[28]。由图1可知，在15 d的氧化过程中，各样品的POV均呈明显上升趋势，大豆油的热稳定性降低。其中SO的氧化稳定性最差，SO组的抗氧化能力最弱；SO-h1的抗氧化能力最强，且抗氧化肽的分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越强，大豆油的热稳定性越强；SO-h1及SO-h2的抗氧化能力均高于SO-VE。SO、SO-h4与SO-h1、SO-h2组间存在差异显著性（P＜0.05）。随着氧化时间的延长，除了SO外，其它样品的过氧化值增加幅度均较小，样品的热氧化稳定性较高。

图1 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油热氧化过程中过氧化值的影响Fig.1 Effects of antioxidant peptide components of British red kidney bean protein on peroxide value of soybean oil during thermal oxidation

综上所述，BRKBPAPC在大豆油的氧化过程中具有抗氧化作用，能增加油脂的热稳定性，且抗氧化肽组分的分子量越低，抗氧化效果越好，分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的两个组分的抗氧化效果比较好。

2.2 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油酸价的影响

酸价（AV）也称酸值，用来衡量油脂中游离脂肪酸的含量，我国规定食用植物油的酸价不得超过5 mg/g。脂肪在储藏时，因微生物、热和酶的共同作用，脂肪会缓慢水解，生成游离脂肪酸，导致油脂酸败，油脂的品质随之而下降[28]。酸价的大小，可以反应大豆油油脂氧化程度。由图2可知，在15 d的加速氧化过程中，各样品AV的变化趋势基本一致，随着氧化时间的延长呈上升趋势，但均小于5 mg/g。SO-h1的抗氧化能力最强，其次是SO-VE；BRKBPAPC分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越强，样品的AV值越低，样品的热氧化稳定越强；SO的抗氧化能力最弱，其次是SO-h3。在不同的氧化时间下，各样品的AV值差异显著（P＜0.05）。分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的两个组分的抗氧化效果比较好。抗氧化肽可以提供氢原子或电子清除大豆油氧化过程中产生的自由基，也可以螯合金属离子抑制油脂的氧化。有研究表明，添加玉米抗氧化肽可以延缓人造奶油酸价的上升[29]。

图2 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分对大豆油热氧化过程中酸价的影响Fig.2 Effects of antioxidant peptide components of British red kidney bean protein on the acid value of soybean oil during thermal oxidation

2.3 英国红芸豆蛋白抗氧化组分对大豆油P-茴香胺值（p-AV）的影响

油脂氧化酸败过程中，会分解产生醛、酮、酯及少量小分子物质，例如羟基醛、酮基醛等，使油脂的茴香胺值增大，茴香胺值是评价油脂品质的一个重要指标[28]。由图3可知，大豆油在加速氧化过程中，随着时间的延长，P-茴香胺值逐渐增大，说明油脂中醛、酮、醌等次级氧化产物在氧化过程中不断增加。在15 d的氧化过程中，样品的热氧化稳定性由强到弱的顺序为：SO-VE＞SO-h1＞SO-Tw＞SO-h2＞SO-h3＞SO＞SO-h4。说明VE、BRKBPAPC对油脂的氧化裂解有一定的抑制作用。BRKBPAC分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越强，分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的两个组分的抗氧化效果比较好。頡宇[24]在研究柠条籽肽对核桃油氧化作用影响的过程中，发现未添加抗氧化肽的核桃油中产生的醛类物质比较多，导致了P-茴香胺值增加。

2.4 英国红芸豆蛋白抗氧化组分对大豆油羰基价的影响

羰基价是指油脂在储存和烹饪加工中产生的含有醛基、酮基的脂肪酸或甘油酸以及聚合物的总称，是油脂热裂变以及贮存时的重要指标，也是反应油脂氧化产物以及油脂酸败程度的重要依据[28]。由图4可知，在15 d的加速氧化过程中，各样品的羰基价均呈明显的上升趋势；在样品的氧化过程中，SO样品的抗氧化活性最弱，其次是SO-Tw；且BRKBPAPC的抗氧化活性与其分子量呈负相关，分子量越小，抗氧化活性越强。其中为分子量为1000 Da和1000～3000 Da的两个组分的抗氧化效果比较好。一些具有合适氧化还原电位的二价或多价过渡金属离子是有效的助氧剂，可以加速大豆油的氧化。抗氧化肽可以螯合大豆油中的金属离子，抑制油脂的氧化分解，抑制羰基化合物的产生。

2.5 大豆油氧化反应中活化能的计算

将不同温度下贮藏过程中的POV值进行拟合，得到回归方程和相关系数，结果如表2所示。

由表2可知，在同一温度下，零级反应的回归系数大于一级反应的回归系数，拟合度高，说明添加分子量小于1000 Da抗氧化肽组分的大豆油的氧化反应属于零级反应。张建飞等[27]、谢贞建等[30]的研究也发现，大豆油的氧化稳定性与温度之间的关系符合零级反应方程式的结论，说明本实验的氧化回归方程属于零级反应回归方程式这一结论具有可靠性。

表2 添加芸豆抗氧化肽组分分子量小于1000 Da的大豆油基于过氧化值的回归方程Table 2 Regression equation based on peroxide value of soybean oil with molecular weight of antioxidant peptide less than 1000 Da

根据Arrhenius方程可以反映油脂变质的速率与所处温度之间的函数关系，方程如下:

对式（1）两边取对数可得:

式中：k0-为方程指前因子；Ea-为活化能，kJ/mol；R-为气体常数，8.314 J/（mol·K）；T-为热力学温度，K。

由式（2）可知，lnk与热力学温度的倒数（1/T）呈线性关系，斜率为-Ea/R，lnk0为常数项。求得不同温度下的反应速率常数后，用lnk对绝对温度的倒数1/T作图，就可求得活化能和指前因子，如图5所示。

由图5可知，-Ea/R=-3190.4，则Ea=26521.66 J/mol= 26.521 kJ/mol。回归系数R2=0.9301，说明lnk与1/T具有较好的线性相关性。在此基础上建立添加分子量小于1000 Da抗氧化肽组分的大豆油氧化反应速率k与贮存温度T之间的Arrhenius方程为：

图5 添加芸豆抗氧化肽组分分子量小于1000 Da的大豆油过氧化值lnk与1/T之间的关系Fig.5 Relationship between the peroxide value lnk and 1/T of soybean oil with the molecular weight of antioxidant peptide less than 1000 Da

3 结论

利用Schaal烘箱法，在63 ℃下，将大豆油加速氧化15 d，发现抗氧化肽具有一定的抗氧化作用，能够增加油脂的热稳定性，且分子量越低，抗氧化作用越强。其中，相对分子质量＜1000 Da，1000～3000 Da两个英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分在大豆油氧化中具有较强的抗氧化作用。为进一步探讨芸豆蛋白抗氧化肽的抗氧化机理及抗氧化肽功能性食品的开发奠定了基础。研究团队在近期将开展英国红芸豆蛋白抗氧化肽咀嚼片的研制，拟为黑龙江省芸豆的开发和产业化提供新的途径。