间苯二酚类热休克蛋白90抑制剂关键中间体5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛合成研究

王 薇， 薛从建， 陈秋缘， 刘巧燕， 李心忠， 刘 洋，5

热休克蛋白90(heat shock proteins，HSP90)是一种ATP能量依赖型蛋白质分子，主要参与调控客户蛋白的活化、折叠等过程，发挥其分子伴侣的作用。在肿瘤细胞中，HSP90表达高于正常细胞2～10倍，且主要处于活化状态[1-3]。许多HSP90的客户蛋白与肿瘤的发生密切相关，如原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、表皮生长因子受体、人表皮生长因子受体-2、血管内皮生长因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT等。通过对HSP90活性的抑制就可同时抑制多种客户蛋白，从多个信号通路抑制肿瘤，提高靶点药物的抗肿瘤活性及减少由单一靶点抑制所引起的耐药性[4-6]。目前研究最多的是间苯二酚类HSP90N端抑制剂。STA-9090和AT13387是该类代表药物，均已进入临床[7-8]，其合成中均有中间体5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛(CAS号1071151-44-4，结构见图1)，而该中间体价格昂贵且需进口。本研究对该中间体的合成工艺进行优化和改进[9-10]，为设计合成新型间苯二酚类HSP90抑制剂及降解剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 旋转蒸发仪(RE-5298，上海申生科技有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司)；超导核磁共振波谱仪(AVANCE Ⅲ，Bruker-BioSpin)，液相色谱-质谱联用仪(6410 Triple Quad LC/MS，安捷伦科技有限公司)；数字熔点仪(WRS-1B，上海仪电物理光学仪器有限公司)；电子分析天平(BSA-224S，赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.1.2 试剂 氢氧化钾和氧氯化磷(国药集团化学试剂有限公司)；2,4-二羟基苯乙酮和三乙基硅烷(上海达瑞精细化学品有限公司)；碘甲烷、三氟乙酸、甲基溴化镁(上海安耐吉化学有限公司)。以上试剂均为化学纯。

1.2 方法 以2,4-二羟基苯乙酮为原料，对2,4位上的酚羟基进行甲基保护，利用格氏试剂甲基溴化镁将5位酮变成异丙醇，再利用三乙基硅烷和三氟乙酸脱去羟基，最后通过三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺制成的Vilsmeier试剂引入甲酰基，得到目标中间体5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，合成路线见图1。

图1 5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛合成路线Fig.1 Synthesis route of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

1.2.1 化合物2的制备 取100 mL圆底烧瓶，将化合物1[2,4-二羟基苯乙酮(5.00 g,32.89 mmol)]溶于N,N-二甲基甲酰胺(9 mL)，加入无水碳酸钾(9.00 g,65.22 mmol)。将其冷却至0 ℃，缓慢滴加碘甲烷(6 mL,92.55 mmol)。滴加完毕后升至室温反应2 h。薄层层析(thin layer chromatography,TLC)监测反应完全后，过滤除去固体，粗滤液用饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯萃取，然后进行浓缩，剩余物用硅胶柱色谱层析分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得化合物2共5.85 g，为白色晶状固体。

1.2.2 化合物3的制备 100 mL双颈瓶中，加入搅拌子，氮气保护下将化合物2,4-二甲氧基苯乙酮(5 g,27.75 mmol)溶于四氢呋喃(50 mL)中并冷却至0 ℃，缓慢滴加甲基溴化镁的四氢呋喃溶液(12 mL,36.00 mmol,3 mol/L),滴加完毕后缓慢升至室温反应16 h。TLC监测反应完全后，先后加入水(5 mL)、饱和氯化铵溶液(20 mL)，用乙酸乙酯萃取，有机相用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤除去干燥剂，浓缩后硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得化合物3共5.00 g，为无色透明油状物，产率91.7%。

1.2.3 化合物4的制备 50 mL圆底烧瓶中加入搅拌子，将化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)丙-2-醇(3.0 g,15.28 mmol)溶于二氯甲烷(30 mL)中并在冰箱预冷却至-10 ℃，加入三乙基硅烷(4.50 g,58.60 mmol)，缓慢滴加三氟乙酸(6.90 g,63.84 mmol)，滴加完毕后缓慢升温至室温反应 5 h，TLC点板监测原料转化完全，停止反应。反应液浓缩后溶于乙酸乙酯，先后用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤。有机相经干燥，过滤后浓缩干后得粗产物经柱层析(石油醚)得化合物4共2.72 g，为无色透明油状物。

1.2.4 化合物5的制备 氮气保护下，将N,N-二甲基甲酰胺(0.43 mL,5.53 mmol)加入二氯甲烷(8.5 mL)并冷却至0 ℃，缓慢滴加三氯氧磷(0.51 mL,5.59 mmol)，滴加完毕后继续在0 ℃下搅拌反应0.5 h，加入1-异丙基-2,4-二甲氧基苯(0.77 g,4.27 mmol)的二氯甲烷溶液(5 mL)，反应温度升至20 ℃并搅拌3 h，TLC点板监测原料转化完全后冷却至0 ℃，缓慢加入水(1 mL)终止反应，浓缩反应液，采用6 N的氢氧化钠溶液(0.24 g/mL)中和至pH值=7，粗产物用乙酸乙酯萃取，有机相盐水洗涤，干燥后浓缩，粗产物经过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得化合物5共0.86 g，为黄色固体粉末。

2 结 果

2.1 化合物2的表征 得2,4-二甲氧基苯乙酮(5.85 g)，性状为白色晶状固体，收率为97.5%。m.p.40.5～41.3 ℃，LC/MS(ESI,m/z):181.1[M+H]+，203.1[M+Na]+。

2.2 化合物3的表征 得2-(2,4-二甲氧基苯基)丙-2-醇(5.00 g)，性状为无色油状液体，收率为91.7%。LC/MS(ESI,m/z):197.1[M+H]+，219.1[M+Na]+。

2.3 化合物4的表征 得1-异丙基-2,4-二甲氧基苯(2.72 g)，性状为无色透明液体，收率为98.9%。LC/MS(ESI,m/z):181.1[M+H]+,203.1 [M+Na]+。

2.4 化合物5的表征 得5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛(0.86 g),性状为黄色晶体，收率97.7%。m.p. 47.5～47.7 ℃，LC/MS(ESI,m/z):209.0[M+H]+,231.0 [M+Na]+。其核磁谱图见图2、3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.19 (s, CHO,1H)，7.51 (s, Ar,1H)， 6.71 (s, Ar,1H)，3.94 (s,2OCH3, 6H)，3.13 [p,J=6.9 Hz, -CH(CH3)2, 1H]，1.13 [d,J=6.9 Hz, -CH(CH3)2,6H]。13C -NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 160.47，158.81，156.74，129.75，124.66，115.10， 94.75，55.93，55.45，26.61，22.69。

图2 5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛核磁氢谱图Fig.2 1H NMR spectrum of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

图3 5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛核磁碳谱图Fig.3 13C NMR spectrum of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

3 讨 论

本研究以2,4-二羟基苯乙酮为原料，用四步合成了HSP90抑制剂中间体5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，总产率达到86.3%。第一步反应2,4-二甲氧基苯乙酮合成因碘甲烷易挥发有毒性，实验条件改为0 ℃和避光后，收率由原文献[9]的80%提高到97.5%。第二步格式试剂亲核加成反应要严格要求做到无水无氧操作，格氏试剂用注射器缓慢加入反应体系中，产率为91.7%，与原文献99%接近。第三步反应中三乙基硅烷和三氟乙酸按照原文献的量进行投料后发现产率极低，而将投料量扩大到原文献的两倍量后发现原料完全反应，收率由原文献的93.0%提高到98.9%。第四步反应1-异丙基-2,4-二甲氧基苯与DMF在三氯氧磷作用下进行Vilsmeier-Haack-Arnold甲酰化反应，在5位引入醛基得到目标化合物5-异丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，该反应实际是芳环亲电取代反应。由于2位和4位甲氧基的定位效应和空间位阻效应影响，甲酰化产物主要在5位，而不是3位。

结果部分目标产物的核磁氢谱已标注出化学位移对用的氢，10.19单峰为醛氢，7.51 和6.71 两个单峰为芳环上两个氢，3.94单峰为甲氧基上6个氢，3.33为水峰，3.13为异丙基上仲氢峰，1.13为异丙基上甲基氢峰。13C -NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 160.47为醛基碳，158.81为4位芳碳，156.74为2位芳碳，129.75、124.66及115.10分别为1、6及5位芳碳， 94.75为3位芳碳，55.93和55.45为两个甲氧基碳，26.61为异丙基上叔碳峰，22.69为异丙基上两个伯碳，氢谱和碳谱数据与目标产物结构一致。

经过优化的合成路线操作简单，反应条件温和，产率高，易纯化，适合中试放大生产，为设计合成新型间苯二酚类HSP90N端抑制剂和降解剂奠定了良好的基础。