超高效液相色谱法测定奥卡西平活性代谢产物的血药浓度

宗静，李发双，茹毅，余绍春，雷嫣，李惠英 (昆明市儿童医院，昆明 650034)

奥卡西平是卡马西平的10-酮基衍生物[1]，临床上主要用于局限性和强直-阵挛性癫痫、三叉神经痛及情感性精神障碍的治疗。奥卡西平服药后药动学过程个体差异大，年龄、性别、联合用药等因素都会影响其疗效及不良反应[2]，因此临床应监测血药浓度。

奥卡西平是前体药物，经口服完全吸收后会迅速代谢为活性产物10，11-二氢-10羟基卡马西平(MHD)，生物利用度约95%[3]，因此监测MHD血药浓度具有临床意义[4]，可有效反映奥卡西平的血药浓度，从而指导临床安全合理用药和制定个体化给药方案，减少药物不良反应。

MHD的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。但前者保留时间较长(6～9 min)[5-7]，目前医疗机构中需要测定MHD血药浓度的患儿与日俱增，太长的保留时间制约了该方法的普及；后者仪器方法成本较高，操作复杂。而超高效液相色谱法避开了这些不足，不但操作简单，而且保留时间明显缩短，相同时间内可以测定更多患儿的血药浓度，能够满足临床需要。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters CQUITY PLC系统(Waters公司，美国)；电子天平(CP114，奥豪斯仪器)；XH-B型旋涡混合器(江苏康健)；低温高速冷冻离心机(Thermo公司，美国)；低速离心机(安徽中科)。

1.2 试剂

10，11-二氢-10-羟基卡马西平对照品(美国QCC，CAS：29331-92-8，纯度≥98%)；6-甲氧基水杨酸标准品(内标，麦克林，CAS：3147-64-6，纯度≥98%)；小牛血清(美国，批号1751588)；乙腈(MercK公司，色谱纯)；高氯酸(国药集团化学试剂有限公司，优级纯)，甲酸(天津化学试剂三厂，分析纯)；实验用水：娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 标准溶液配制

分别精密称取MHD和内标物质各10 mg，甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得到浓度为1 mg/mL的标准溶液。

2.2 样品处理

取200 μL血清于EP管内，加入内标6-甲氧基水杨酸20 μL，涡旋混合后加入7%高氯酸200 μL，涡旋1 min后，室温下以转速14 000 r/min高速离心11 min，取上清液进样检测。

2.3 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相为0.05%甲酸∶乙腈=75∶25(V/V)，检测波长254 nm，流速0.20 mL/min，柱温40 ℃。MHD保留时间1.81 min，内标保留时间2.68 min，二者分离好，无血清内源性物质干扰，见图1。

2.4 标准曲线

取180 μL空白血清至EP管中，分别加入MHD标准工作液及内标工作液20 μL，涡旋混匀，制备成理论浓度为100、75、50、25、10、5 μg/mL的标准曲线血浆样本。按“2.2项”对样本进行处理，“2.3项”下的色谱条件进行样本测定。MHD峰面积与内标峰面积比值(y)对浓度比值(x)绘制标准曲线，得回归方程为y=0.070 4x-0.014 3，r=0.999 9，线性范围为5～100 μg/mL。

2.5 精密度、准确度实验

取空白血清，分别制成100、50、10 μg/mL的高、中、低浓度的血清样品，按“2.2项”、“2.3项”下进行处理测定，每个浓度日间测定5次，得到日内精密度，连续测定5 d，计算日间精密度，见表1。

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表1 MHD精密度、准确度结果

2.6 回收实验

对照样本的制备：精密吸取160 μL小牛血清至离心管中，分别精密加入MHD标准曲线工作液20 μL、内标20 μL及水20 μL，涡旋混匀，制备成理论含MHD浓度为10 μg/mL的血浆样本，并平行制备5个样本。

加标样本的制备：精密吸取160 μL小牛血清至离心管中，分别精密加入20 μL MHD标准曲线工作液、内标20 μL，共3份，再分别加入20 μL MHD标准液，制备成理论浓度为60、35、20 μg/mL的血浆样本，每个浓度平行制备5个样本。

按“2.2项”下处理样本，“2.3项”下色谱条件分析，并记录二者峰面积，计算两者比值y，将其带入标准曲线计算样品浓度，并分别计算同一浓度样本的实测浓度的平均值、标准差、以及加标回收率的平均值、标准差和相对偏差，见表2。

表2 MHD加标回收率结果

2.7 稳定性实验

分别配制高、中、低3个浓度的血清样品，按“2.2项”下方法处理血样，分别置于室温、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱，分别按“2.3项”色谱条件进样测定，考察血清样品在室温、冷藏及冻融条件下MHD的稳定性，结果显示MHD和内标在以上温度条件下均保持稳定，见表3。

表3 MHD稳定性实验结果

3 讨论

奥卡西平与传统抗癫痫药物相比，具有患者耐受性好、药物相互作用少、对肝药酶诱导作用小等优势，广泛用于儿童癫痫治疗[8]。但该药治疗窗较窄，药代动力学受年龄、性别、体质量等多种因素影响，个体差异较大[9]，且患儿服用该药后出现的不良反应时间、严重程度不一，因此，在儿科临床应用中监测血药浓度是很有必要的，不仅有利于疗效评价，还可以减少不良反应，从而更安全、有效、合理用药。

样本前处理方法参考国内外文献[10-11]，采用甲醇、乙腈等进行蛋白沉淀，但回收率都不甚理想，采用7%高氯酸进行蛋白沉淀，经高速离心后取上清液进样，峰型较好、回收率较高。

本实验内标物的选择参考文献[12-13]，实验比较了甲硝唑、对氨基苯甲酸、6-甲氧基水杨酸，结果显示甲硝唑和对氨基苯甲酸出峰时间较早，容易与血浆内源性物质峰重合，调整色谱条件也较难分开。而6-甲氧基水杨酸能与待测物分开且分离度较好，无内源性物质干扰，并且较稳定，符合内标要求。

流动相选择参考文献[14]，比较乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.05mL/L磷酸二氢钾，实验显示甲酸-乙腈峰形较好，通过调整甲酸比例使得拖尾较小，选择0.05%甲酸∶乙腈=75∶25作为流动相，发现其峰型较好，分离度符合标准。

MHD在240 nm和254 nm有特征吸收峰。经过实验对比，254 nm处的信号优于240 nm，因此选择254 nm作为本实验检测波长。

本课题建立了测定MHD血药浓度的超高效液相色谱法，该方法操作简便、稳定性较好、易于重复且经济快捷，可以用于临床血药浓度的监测。