基于网络药理学及分子对接技术探讨定喘汤治疗儿童咳嗽变异性哮喘的作用机制

程爽，李园，张子薇，方顺顺，吕显威，孙洮玉 (北京中医药大学东直门医院，北京 100007)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是儿童慢性咳嗽常见的原因之一[1]，以咳嗽为唯一或主要表现[2]。有报道指出，如不干预治疗，约30%的CVA会转变为典型哮喘，影响患儿身心健康[3-4]。目前西医治疗CVA以吸入性糖皮质激素、支气管舒张剂和口服白三烯受体拮抗剂为主。但我国儿童哮喘的病情控制并不理想，有20%以上儿童哮喘未达到良好控制[5]。中医既往论著中并没有CVA对应的病名，许多医师根据自己对本病的认识提出了哮咳、风咳等观点[6-7]，在治疗上积累了不少经验，其中就包含定喘汤的应用[8-11]。

定喘汤见于《摄生众妙方》，为宣肺降气、化痰平喘的经典方剂，方中共有麻黄、白果、桑白皮、黄芩、苏子、杏仁、半夏、款冬花、甘草9味中药。定喘汤临床用于支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病的治疗[12-13]。现代药理研究证明定喘汤具有化痰、平喘、抗炎等作用[14]。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科，其突出特点是强调对信号通路的多途径调节，以提高药物的治疗效果。而中药复方制剂恰恰具备多成分、多功效的特点，与网络药理学具有很高的相似性。本研究通过网络药理学和分子对接技术，预测并验证定喘汤治疗CVA可能的作用机制，为进一步开发药物提供参考。

1 方法

1.1 工具

数据库：中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，网址https://tcmspw.com/tcmsp.php；全球蛋白质资源(universal protein resource，UniProt)，网址https://www.uniprot.org/；基因卡片(GeneCards)，网址https://www.genecards.org/；在线《人类孟德尔遗传》(online Mendelian inheritance in man，OMIM)，网址https://www.omim.org/；String，网址https://string-db.org/；用于注释、可视化和集成发现的数据库(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)，网址https://david.ncifcrf.gov/；PubChem，网址https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/；蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)，网址https://www.rcsb.org/。

软件：Excel 2020；Cytoscape 3.7.2；Chemoffice；PyMOL；AutoDock Vina；AutoDockTools。

绘图工具：微生信网站，网址http://www.bioinfor-matics.com.cn/。

1.2 定喘汤活性成分及靶点

利用TCMSP数据库获取定喘汤中9种药物的所有成分，将口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-like，DL)≥0.18作为筛选条件，筛选出活性成分。此外，通过查阅已发表的文献，补充因筛选指标而被舍弃的活性成分。通过TCMSP获取活性成分的作用靶点，将结果导入UniProt中，选择已验证的、人源性基因，将靶点转化为标准化的基因名。

1.3 CVA疾病靶点筛选

通过GeneCards输入关键词“cough variant asthma”，按照相关性得分(relevance score)取前25%的疾病靶点，获取CVA疾病靶点；通过OMIM获取全部CVA疾病靶点，取两个数据库靶点交集得到CVA疾病靶点。

1.4 定喘汤药物靶点和CVA疾病靶点交集

运用Excel 2020得到药物靶点与疾病靶点的交集靶点，利用微生信网站制作韦恩图。

1.5 构建“中药-活性成分-靶点”调控网络和蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络

利用Cytoscape 3.7.2软件，构建“中药-活性成分-靶点”调控网络，通过网络拓扑分析筛选出Degree≥2倍中位数的核心成分。将“1.3”项得到的交集靶点导入String数据库，设定物种为人(homo sapiens)，互动分数(interaction score)≥0.4，获取PPI网络数据，将其导入Cytoscape 3.7.2软件，构建PPI网络，筛选节点Degree≥2倍中位数的节点，获取核心靶点。

1.6 基因生物过程分析(GO-BP)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析

将交集靶点导入DAVID数据库，进行GO-BP和KEGG通路富集分析，获取交集靶点的关键生物进程和通路信息，分析定喘汤治疗CVA的可能机制。

1.7 分子对接

在PPI网络得到的核心靶点中选取排名前三的核心靶点，在“1.5”项“中药-活性成分-靶点”网络中筛选出 3个核心靶点共同对应的活性成分，并将所得活性成分与“1.5”项获得的核心成分取交集。利用PubChem数据库获取核心成分的2D结构，并用Chemoffice软件将2D结构转化为3D结构，即可得到小分子配体。利用PDB数据库获取核心靶点蛋白质的3D结构，利用PyMOL软件去除靶点蛋白的水分子和小分子配体，即可得到蛋白受体。利用AutoDockTools软件将小分子配体和蛋白受体文件转化为pdbqt格式，再利用AutoDock Vina软件将 3个核心靶点与交集核心成分进行分子对接。

2 结果

2.1 定喘汤活性成分及靶点

筛选得出活性成分194个，查阅已发表的文献补充活性成分24个，共计218个。通过TCMSP得到活性成分的潜在靶点452个。

2.2 CVA疾病靶点

在GeneCards中按照相关性得分取前25%的疾病靶点，获取CVA疾病靶点563个，通过OMIM获取CVA疾病靶点146个，取两个数据库靶点交集得到CVA疾病靶点689个。

2.3 定喘汤药物靶点和CVA疾病靶点交集

运用Excel得到药物靶点与疾病靶点的交集靶点131个，并制作韦恩图，见图1。

图1 药物-疾病交集靶点

2.4 “中药-活性成分-靶点”调控网络与PPI网络

利用Cytoscape 3.7.2软件，构建“中药-活性成分-靶点”调控网络(图2)。网络中的节点为药物名称、活性成分、靶点，边为活性成分与基因之间的相互关系。靶点用蓝色菱形表示，9种药物的活性成分分别用9个圆环表示，圆环圆心代表药物名称，两侧两列活性成分为不同药物中的相同活性成分。根据Degree进行网络拓扑分析和网络可视化调节，Degree越大，该节点在网络中连接的点越多，影响力越强。筛选出Degree≥2倍中位数的中药成分22个，见表1，这些中药成分可视为定喘汤治疗CVA的核心成分。

图2 “中药-活性成分-靶点”调控网络

表1 定喘汤治疗CVA的核心成分

将131个交集靶点导入String数据库，构建PPI，将结果导入Cytoscape 3.7.2软件(图3左)，先后筛选Degree≥1倍中位数(图3中)、Degree≥2倍中位数的节点(图3右)，获取关键靶点，所得靶点可视为定喘汤治疗CVA的核心靶点。

图3 蛋白互作网络与核心靶点

2.5 GO和KEGG富集分析

将131个交集靶点导入DAVID数据库，进行GO和KEGG富集分析，得到生物过程720条，主要与RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的调控、对药物的反应、细胞增殖、炎症反应、对脂多糖的反应、细胞凋亡、免疫反应、一氧化氮(NO)生物合成、MAPK级联激活等有关；通过KEGG富集得到121条通路，主要涵盖PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路等。分别选取排名前20的生物过程及通路制作气泡图，见图4、图5。

图4 GO-BP分析

图5 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接

分别将槲皮素、木犀草素、白藜芦醇、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、汉黄芩素与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)进行分子对接，结果显示15组分子对接结合能均≤-6.6 kcal/mol，展现出良好的结合力，见表2。其中，AKT1和IL-6与EGCG结合最好、TNF与木犀草素结合最好，见图6。

表2 核心成分与核心基因结合能量 kcal/mol

图6 分子对接结果(从左到右依次是EGCG与AKT1、EGCG与IL-6、木犀草素与TNF)

3 讨论

目前，CVA的治疗仍以西医治疗为主，目的在于良好或完全地控制病情，预防未来风险的发生。然而有研究指出，患儿家长的疾病控制知信行现状仍不理想[15]，患儿吸入糖皮质激素治疗依从性仅为37.3%[16]。定喘汤中麻黄辛温，宣肺平喘，解表散寒，白果甘涩，敛肺定喘，祛痰止咳，二药合用，一散一收，共为君药；桑白皮泻肺平喘，黄芩清肺泻热，二药合用，清肺降逆，共为臣药；苏子降气化痰，杏仁止咳平喘，半夏燥湿化痰，款冬花下气止咳化痰，俱为佐药；甘草调和诸药，且能止咳，为使药。诸药合用，外散风寒，内清痰热，降气平喘。中药方剂的复杂性给作用机制的研究造成一定困难，本研究借助网络药理学和分子对接技术，为定喘汤治疗CVA作用机制的研究提供新的思路和方法。

本研究共得到218个活性成分，核心成分22个。槲皮素、木犀草素、汉黄芩素均为黄酮类化合物，具有较强的抗炎抗氧化作用。研究表明，槲皮素和木犀草素能够抑制血管内皮生长因子(VEGF)，从而发挥抑制CVA患儿气道重构的作用[17]。白藜芦醇是一种天然多酚，具有抗氧化、抗炎、保护心脏和抗癌的特性，实验证明白藜芦醇可以减轻纤维化反应和气道炎症，抑制肥大细胞中Syk蛋白的表达和脱颗粒[18]。EGCG是绿茶中的一种多酚，有研究表明它可显著降低哮喘症状，肺炎性细胞浸润以及IL-2、IL-6和TNF-α的炎性因子水平[19]。汉黄芩素可以通过调节Th1/Th2细胞因子平衡和肥大细胞释放组胺，达到治疗过敏性哮喘的作用[20]。汉黄芩素还可诱导嗜酸粒细胞凋亡并减轻变应性气道炎症[21]。

通过PPI网络得到核心靶点，Degree位于前三的分别为AKT1、IL-6、TNF。其中，AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白参与多种生物学过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长、血管生成等[22]。IL-6是一种功能广泛的多效应细胞因子，可以调节多种细胞的生长与分化，在慢性炎症反应中扮演着重要角色。一项成人哮喘的研究结果显示，IL-6与成人发作哮喘的风险相关[23]。另有研究发现，人支气管上皮样细胞(16HBE)中的SIRT1低表达可上调IL-6表达，而AKT抑制剂可逆转该表达，SIRT1通过AKT调节IL-6水平，从而影响哮喘患者的肺功能[24]。TNF是一类涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌。一项埃及的研究表明，TNF-α基因多态性可能与儿童支气管哮喘的发生有关，支气管哮喘患者的TNF-α水平升高更为显著[25]。

GO-BP分析主要涉及炎症反应、对脂多糖的反应、NO生物合成、MAPK级联激活等生物进程。有研究表明，脂多糖在亚洲沙尘引起的过敏性气道炎症中可增强中性粒细胞的聚集，从而加剧过敏性气道炎症[26]。NO已被证实有广泛的生物功能，包括舒张血管、扩张支气管、传递神经信号、参与炎症反应和免疫等，临床中呼出气一氧化氮(FeNO)的测定也被公认为检测气道炎症的指标[27]。MAPK是以三级激酶依次激活的方式进行信号传导的，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，这三种激酶共同调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等众多生物过程。现代研究证实，卵白蛋白过敏哮喘小鼠模型暴露于臭氧环境时，哮喘症状会加重，而其中p38-MAPK和氧化应激均在此过程中起关键作用，抑制这两个生物过程可显著减轻暴露于臭氧环境的哮喘小鼠症状[28]。

KEGG富集分析结果显示，定喘汤作用于CVA的靶点主要涉及PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路等。有研究[29]显示，白藜芦醇的抗炎特性可能是因为抑制了PI3K-Akt通路、从而减少炎性介质IL-6、NO的产生。TNF信号通路和Toll样受体信号通路是反映炎症的重要通路，有研究证明，哮喘丸治疗哮喘可能通过抑制TNF信号通路和Toll样受体信号通路相关蛋白质的表达和细胞因子的分泌，降低炎症反应，增强机体免疫功能实现，且该研究证实其机制与孟鲁司特钠治疗CVA的机制相似，能明显抑制TLR4、MyD88、p65和p-p65等蛋白表达，且明显降低哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α水平，提高IFN-γ水平[30]。

分子对接的结果提示定喘汤中的5个核心成分与AKT1、IL-6、TNF结合后均产生了良好的亲和力，也验证了本研究的结果。

综上所述，本研究通过网络药理学对定喘汤治疗CVA的活性成分、核心靶点以及可能的作用机制进行研究，并通过分子对接技术对上述结果进行验证，证实了定喘汤治疗CVA具有多成分、多靶点、多通路的特点，为进一步研究定喘汤治疗CVA的作用机制提供了参考数据。