利妥昔单抗治疗特发性局灶节段肾小球硬化的机制和疗效

闵 敏 张 炯 综述 王金泉 审校

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的全球发病率约为7/100万，是导致终末期肾病(ESRD)常见的肾小球疾病[1]。FSGS是多种肾小球疾病共有的特征性组织病理改变，主要病变靶点在足细胞。特发性FSGS临床主要表现为肾病综合征，糖皮质激素为治疗基石。国内研究报道成人初治FSGS患者激素治疗完全缓解率25.8%，总有效率83.9%[2]。除激素抵抗患者外，部分患者在治疗中表现为反复复发或激素依赖，需长期使用大剂量激素，有可能出现激素相关的不良反应。对于激素抵抗、反复复发或激素依赖的患者，通常加用免疫抑制剂(如环孢素A、他克莫司、吗替麦考酚酯、环磷酰胺等)，此类药物的疗效特征以及不良反应限制了其长期使用，仍有约20%的患者对上述治疗无效，3～5年内进展至ESRD。临床上迫切需要新的手段来解决FSGS治疗的窘境。利妥昔单抗(RTX)是一种B细胞耗竭剂，已被批准用于治疗B细胞淋巴瘤、抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关血管炎、过敏性紫癜等疾病。KDIGO推荐RTX用于激素依赖和激素抵抗的肾病综合征患者。已有多中心、双盲、随机对照研究证实,RTX在儿童反复复发和激素依赖肾病综合征患者中的确切疗效[3]。与此同时,陆续有成功应用RTX治疗FSGS的报道，为难治性FSGS患者带来了新的希望。但是，RTX治疗FSGS的疗效机制并不清楚。本文从FSGS发病机制出发，结合RTX的分子药理特性，进一步阐述RTX治疗FSGS的免疫学机制和足细胞保护机制，旨在为FSGS的治疗探索更多的临床路径。

参与特发性FSGS的发病机制

T细胞特发性FSGS的发病机制不明，免疫病理通常表现为寡免疫复合物或仅有少量IgM和(或)补体C3沉积，激素治疗有效。因而，最早认为其发病与T细胞有关。1974年，Shalhoub[4]在无体液免疫证据但激素治疗有效的特发性肾病综合征患者中，观察到麻疹可诱导肾病综合征的自发缓解，首次提出T细胞介导特发性肾病综合征发病的观点，后续的研究也验证了这一观点。如Buffalo/Mna 为自发性FSGS大鼠模型， 8周龄时出现蛋白尿，这一过程伴随巨噬细胞活化和Th2淋巴细胞标志物表达，在CD4+CD25+T淋巴细胞(调节T细胞亚群)转移后，模型大鼠的蛋白尿减少，肾小球损害减轻，提示T细胞，尤其是调节T细胞在FSGS致病及治疗中起作用[5]。

B细胞近年来随着针对B细胞CD20的单克隆抗体——RTX应用于临床，陆续报道RTX成功治疗FSGS，B细胞在FSGS致病机制中的作用备受重视。过去有研究，部分淋巴细胞增生性疾病和慢性淋巴细胞白血病患者可出现肾病综合征或肾小球病变，这类患者在接受针对B细胞的治疗后，肾脏病相关症状随着B细胞耗竭而缓解[6]。临床实践中还观察到免疫吸附可减少FSGS患者的蛋白尿[7]。临床应用B细胞免疫抑制剂(环磷酰胺或霉酚酸酯)治疗FSGS有效,支持B细胞在特发性FSGS中的作用。近来研究，一种针对泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)的IgG抗体能引起足细胞脱离，与特发性肾病综合征的复发有关[8]。动物实验证实，肾脏中局部激活的B细胞能产生白细胞介素4(IL-4)诱导肾小球损伤产生蛋白尿，同时观察到在微小病变肾病(MCD)患者的肾活检组织中STAT6激活(由IL-4诱导)增加[9]。研究报道MCD复发与记忆B细胞重建有关[10]。通常认为FSGS与MCD是同种疾病的不同发展阶段,提示B细胞参与FSGS发病。RTX可耗尽外周血中的B细胞，但次级淋巴器官中仍有B细胞，剩余B细胞表型、功能发生了改变，进而T细胞免疫也受到影响[11]。目前，很难找到B细胞参与FSGS发病机制的确切论据，而B细胞与T细胞两者存在紧密的免疫作用网络，并不能完全区分开来。

循环因子足细胞损伤是FSGS的致病基础。在特发性FSGS，循环因子致病学说广受认可。临床上观察到部分FSGS导致的ESRD患者在肾移植后即刻复发，且部分移植后复发FSGS(ptFSGS)患者血浆置换有效。报道将复发的移植肾再次移植至糖尿病肾病患者体内，蛋白尿即刻消失[13]。体外实验证实在正常人足细胞培养液中加入ptFSGS患者血清，可影响足细胞骨架结构。进一步证实,特发性FSGS患者的体液中存在某些可溶性的循环因子，这些循环因子介导了FSGS的发生。

对循环因子的探索是肾脏病学领域的圣杯，究其来源，主要有以下几种推测：(1)来源于T细胞；(2)来源于B细胞；(3)来源于足细胞。不论所谓的循环因子具体为何生物学特征，其参与FSGS致病的机制均考虑有直接的足细胞损伤。体外对足细胞培养的观察发现，ptFSGS患者血清可影响整合素链接激酶、酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b(SMPDL-3b)及酸性鞘磷脂酶(ASMase)的活性，提示循环因子可能是通过影响与足细胞功能相关的酶活性参与致病[13]。目前认为与FSGS发病相关的循环因子主要有：可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)、心脏营养素样细胞因子 1(CLCF-1)、抗CD40抗体及载脂蛋白A1(ApoL1)。其中suPAR是该领域的研究热点。研究发现FSGS患者血清suPAR浓度较正常对照组及其他肾小球疾病组升高。suPAR可通过激活足细胞中αvβ3整合素，导致足细胞骨架重排、足突消失[14]。

RTX治疗FSGS的免疫学机制

RTX是特异性针对B细胞表面CD20抗原的人鼠嵌合单抗，可通过细胞凋亡、补体依赖的细胞毒作用、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用三种途径特异性地杀死表达CD20的B细胞，调节自身免疫。

对接受RTX治疗的FSGS患者观察发现，治疗前T细胞活化状态影响RTX效果，除了耗竭B细胞外，RTX还影响FSGS患者CD3+/CD4+细胞比值[10]。对FSGS患者的T细胞亚群流式分析显示，在RTX治疗前，治疗有效组患者T细胞活化较治疗无效组低,具体表现为有效组治疗前CD154+CD4+CD3+细胞、IFN-γ+CD3+细胞、IL-2+CD3+细胞数量低；RTX 治疗6个月后，有效组患者的CD154+CD4+CD3+细胞、IFN-γ+CD3+细胞、IL-2+CD3+细胞的数量较基线值显著上升，而无效组上述细胞治疗前后无明显变化。研究显示上述三组T淋巴细胞亚群是判断RTX治疗FSGS疗效的良好预测因子，作者推测RTX可能通过对T细胞的激活、功能或亚群的调节起到治疗FSGS的作用。

除产生自身抗体B细胞外还有非抗体依赖性功能，可通过抗原提呈、协同刺激、产生细胞因子来调节T细胞功能。因此，清除B细胞不仅与自身抗体的清除相关，还可独立于自身抗体参与自身免疫。在一些明确由T细胞介导的自身免疫性疾病(如多发性硬化、1型糖尿病、类风湿关节炎)中，RTX也显示出良好疗效，治疗后B细胞及T细胞亚群的数量及活化程度均受到影响[15]。由于RTX是B细胞靶向药物，因此RTX对T细胞的调控，很可能是通过B细胞-T细胞间相互作用这种间接方式实现的。CD40(CD154)是由抗原提呈细胞(B细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞)表达的共刺激因子， CD4+T细胞表面表达CD40配体，当表达CD40配体的CD4+T细胞被激活时，可产生IFN-γ和IL-2[10]。上述研究中，RTX治疗FSGS有效组患者的基线IFN-γ、IL-2、CD154表达降低，显示这类患者的B细胞-T细胞相互作用环节存在问题。有理由推测在FSGS的致病过程中，B细胞通过持续产生细胞因子或激活抗原提呈细胞与T细胞相互作用，从而降低了T细胞对外界刺激的反应性，而 RTX对B细胞的清除，解除了T细胞功能低下或被抑制状态，促进疾病缓解。B细胞可以通过递呈抗原和提供共刺激增强T细胞反应；产生某种细胞因子的B细胞也可以具有相反的作用，即抑制T细胞反应。RTX或许可通过清除外周血B细胞，间接调节T细胞的功能，并且这种调节可能是双向的。但确切作用机制仍有待进一步研究。

RTX的足细胞保护机制

在组织病理上，FSGS的致病核心为足细胞损伤。诸多临床研究和体外实验均提示， RTX治疗FSGS的疗效与外周血B细胞数目无明显关联，且外周血B细胞的数量对于疾病的缓解和复发也无指导意义[16-17]，提示RTX可通过非B细胞依赖的方式起作用。SMPDL-3b位于细胞膜的脂筏中，可将鞘磷脂转化为神经酰胺，神经酰胺是参与细胞周期和凋亡的重要细胞信号。SMPDL-3b 能够稳定足细胞激动蛋白骨架，对足细胞起保护作用，正常足细胞表达SMPDL-3b，FSGS患者肾组织中的SMPDL-3b表达降低。ASMase与SMPDL-3b 同源，参与鞘磷脂分解代谢过程。Fornoni等[13]的体外实验表明，RTX能直接与足细胞上的SMPDL-3b结合，阻止其下调，并通过调节ASMase活性，稳定足细胞细胞骨架，延缓疾病进展(图1)[18]。阿霉素大鼠是一种非免疫细胞诱导的肾病综合征模型，在这一模型中，大鼠肾组织SMPDL-3b、Nephrin、 Podocin表达显著降低，RTX可阻止这一现象，显著减少蛋白尿。在正常小鼠中，RTX也可增加肾组织SMPDL-3b mRNA的表达，但不产生补体激活或白细胞募集效应[19]。

图1 利妥昔单抗对足细胞的直接影响作用[18]SMPDL-3b:酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b;ASMase:酸性磷酸鞘脂酶;FSGS:局灶节段性肾小球硬化;TRPC6：瞬时受体电位通道蛋白6；β-DG：肌营养不良蛋白聚糖β；ILK：整合素连锁激酶；移植后复发FSGS患者血清通过某种机制诱导SMPDL-3b和ASMase的下调，进而影响肌动蛋白纤维的形成和足细胞的存活；利妥昔单抗与SMPDL-3b结合，阻止了患者血清对SMPDL-3b和ASMase的下调，起到保护足细胞的作用

Yoo等[20]的研究表明SMPDL-3b干扰suPAR 激活αvβ3整合素信号。FSGS循环中suPAR增加、肾组织SMPDL-3b低表达或缺失，αvβ3整合素激活，最终导致足细胞的迁移表型改变。糖尿病肾病患者suPRA水平升高、肾组织SMPDL-3b表达增加，SMPDL-3b与suPRA结合，阻止αvβ3整合素激活,介导足细胞凋亡。足细胞过度迁移和凋亡均可致足细胞减少，肾组织SMPDL-3b表达增加使足细胞从迁移表型向凋亡表型转变。 SMPDL-3b浓度可调节足细胞的细胞表型，提示RTX或许能间接作用于可溶性循环因子治疗FSGS，如通过上调SMPDL-3b表达，与suPAR 结合，改变足细胞细胞表型，起到足细胞保护作用。上文所述， 来自B细胞的IL-4可致足突融合产生蛋白尿[9]。最新的动物实验证实,IL-9参与FSGS的致病过程， 致病的IL-9主要来源于T细胞，实验证实IL-9主要通过非免疫机制即直接作用于足细胞，介导FSGS的肾小球肾伤[21]。提示FSGS致病涉及免疫学机制和非免疫学机制，故 RTX治疗FSGS的疗效机制或许并不是单一的，而是一种多机制介导的复杂过程。

RTX在FSGS中的疗效

目前RTX主要用于治疗激素和(或)免疫抑制剂抵抗、频繁复发或激素依赖的FSGS，相关研究报道主要集中在儿童群体。报道显示，在儿童FSGS，RTX可诱导肾脏缓解，减少复发，降低激素/免疫抑制剂使用剂量。已有随机对照研究证实,RTX在儿童反复复发、激素依赖肾病综合征中的确切疗效[3]。临床上RTX已成为儿童FSGS的重要补充治疗，得到较为广泛的应用。而RTX治疗成人FSGS的报道较少见(表1)。Hansrivijit等[31]的Meta分析显示,成人FSGS患者接受RTX治疗的总体缓解率为53.6%，完全缓解率为42.9%，复发率为47.3%。Kronbichler等[32]对RTX治疗成人复发性FSGS和MCD进行了系统回顾，结果发现RTX有助于减少复发次数及减少激素和免疫抑制剂剂量。2021年的一项最新Meta分析显示，RTX治疗成人FSGS的完全缓解率为43%，复发率29.8%，安全性分析显示RTX具有良好耐受性[33]。总体来看，RTX的疗效对反复复发或激素依赖FSGS优于激素抵抗FSGS，对儿童优于成人。此外研究显示，RTX对初始治疗或血浆置换无效的ptFSGS患者有效[34]，预防性使用RTX可降低高危FSGS患者移植后蛋白尿的发生率[35]。

表1 利妥昔单抗治疗成人FSGS的临床研究

小结:RTX可能通过免疫和足细胞保护双重机制达到治疗特发性FSGS的目的。一方面，RTX可通过B细胞清除间接影响T细胞；另一方面，RTX可作用于足细胞上的SMPDL-3b稳定足细胞骨架结构。RTX可提高FSGS患者的肾脏缓解率，降低复发率及激素/免疫抑制剂的使用剂量，降低ptFSGS的发生率、提高缓解率，但上述观点仍需随机对照研究的进一步证实。随着对靶向药物的推进和深入研究，RTX在FSGS中的应用还需要基础研究和临床研究相结合展开。