活体中的真菌孢子和培养真菌孢子的共焦显微镜对照研究

张醇 程灿 应方微 吕洁璇 林宝涛 于莉 严宗辉 聂丹瑶 黎明

真菌广泛分布于我们生活的环境，在正常情况下人体有皮肤等屏障可以阻止真菌的侵入，但在眼部外伤，特别是植物外伤后，真菌感染角膜引起真菌性角膜溃疡，甚至是真菌眼内炎[1-3]。该病的临床症状重，用药时间长，同时复发率也较高，在部分缺乏检查手段的地区确诊有一定困难。临床上，对该病的早期诊断和早期治疗对患者的视力预后至关重要，有助于减少临床误诊、角膜穿孔、眼内炎等严重预后，对挽救患者的视力作用非常显著[2-5]。近年来，我国眼科临床应用活体角膜共焦显微镜，能早期、快速地在真菌性角膜溃疡中发现真菌菌丝，从而早期确诊该病，并通过该设备仪器的检查结果指导临床用药治疗[1-5]。

临床上通过角膜共焦显微镜确诊的真菌性角膜溃疡，大部分都是丝状菌所致，国内少有关于孢子致病的报道，这是因为致病孢子较小，直径不到1 μm，在共焦显微镜下容易与眼部的杂质或者是那他霉素滴眼液的药物粉尘相混淆，临床确诊困难[1-5]。我们采用激光角膜共焦显微镜，对11例角膜溃疡刮片、培养确诊为近平滑假丝酵母菌患者的角膜溃疡灶和培养菌落涂片进行检测，研究其共焦显微镜图像的特点，为早期诊断该病打下基础，报道如下。

资料与方法

一、一般资料

(一)入选标准：1.患者有以下病史之一：(1)明确的外伤史，特别是植物伤史;(2)角膜接触镜佩戴;(3)长期激素应用病史;(4)化疗或者免疫抑制剂应用病史；2.角膜溃疡有以下特点之一：(1)溃疡边界毛糙、不光滑，边缘可呈毛刷状，周边可有伪足、卫星灶或免疫环;(2)角膜溃疡灶有干硬感或云雾状;(3)可伴有前房积脓、内皮斑或者后弹力层皱褶等较重的炎症反应；3.溃疡灶处刮片取材、真菌培养阳性，致病菌鉴定为近平滑假丝酵母菌[1-5]。

(二)入选对象：从2008年11月至2018年11月在本院溃疡刮片、真菌培养鉴定为近平滑假丝酵母菌性角膜溃疡患者共11例(11只眼)，其中男性8例，女性3例；左眼4例，右眼7例。患者年龄(31±4.7)岁(24～49岁)。起病时间(19±4.6)d(14～26 d)。

二、真菌取材培养方法：采用0．5%爱尔凯因滴眼液点患眼3次表面麻醉，固定患睑，采用自制胡须刀片在角膜溃疡灶处刮取新鲜的病变组织，在无菌操作台中分别接种于沙氏培养基(SDA)和马铃薯培养基(PDA)，然后在25 ℃培养箱中培养7～14 d，每日观察，菌种鉴定时将培养物转种察氏基做小培养，观察菌落形态和镜下特征。

三、近平滑假丝酵母菌角膜溃疡灶的角膜激光共焦显微镜的活体检查方法：(1)表面麻醉：采用0.5%爱尔凯因滴眼液麻醉患眼3次；(2)镜头准备：用丙酮棉签清洁共焦显微镜头的前表面后，点上一大滴VidisicTM凝胶作为耦合剂，点凝胶时应避免气泡逸入其中；(3)共焦显微镜镜头帽安装：将共焦显微镜Rostock角膜接触帽从无菌包装中取出，安装于物镜头上，使镜头帽通过耦合剂与物镜连接；(4)患者体位、头位及眼位：患者坐于检查台前，头部的前额和下颌分别紧靠头托和下颚托，眼位注视前方的固视光点；(5)CCD摄像头的位置：应调节CCD悬臂使CCD摄像头的光轴与激光扫描摄像头的光轴垂直；(6)将共焦显微镜激光物镜头前移至患者角膜前5～10 mm处，通过位移微调，使Rostock角膜接触帽与角膜中心接触；(7)再微调共焦显微镜物镜头及焦距，当显示器上出现角膜图像时踩下记录所需图像，最后通过显示器筛选需要的图象并存盘；(8)溃疡灶的选点：选择溃疡灶的中央、周围浸润灶与透明角膜交界区的上、下、鼻和颞侧共5 点为特定检查位点；(9)检查注意事项：检查时，物镜头需绕溃疡灶检查1周，以免遗留死角；。(10)检查后对获取图像进行评估，应注意溃疡灶中真菌孢子的有无、孢子密度的高低及形态。

四、对培养近平滑假丝酵母菌菌落的激光共焦显微镜检查方法：(1)镜头准备：用丙酮棉签清洁共焦显微镜头的前表面后；(2)将培养基上的菌落转接涂抹于Rostock角膜接触帽的外表面，点上一大滴VidisicTM凝胶作为耦合剂，再将其装在物镜头上；(3)打开电源开关，通过微调调整，扫描角膜接触帽外表面的菌落图象，同时踩下记录按钮，记录所需图像。

结 果

一、角膜激光共焦显微镜观察活体近平滑假丝酵母菌角膜溃疡灶的特点

为了便于描述，我们根据溃疡灶处孢子的多少，孢子有无聚集成团现象以及聚集的程度，分类进行介绍。

第一类、溃疡灶处有孢子出现，孢子数量可多可少，但孢子尚无聚集成团的现象(图1～4)。

第二类、溃疡灶处大量孢子聚集，形成不同形状的高反光团块状结构，但这些聚集的孢子密度还不够大，激光尚能穿过成像(图5～8)

第三类、团块状聚集的孢子进一步聚集叠加，孢子团密度增高，影响激光穿过成像，孢子团中央为暗区，成像不清(图9～图11)。

二、近平滑假丝酵母菌培养菌落涂抹在激光共焦显微镜下的特点

培养鉴定后的近平滑假丝酵母菌养菌落，涂抹于角膜接触帽的外表面，再将其装在物镜头上，采用激光角膜共焦显微镜观察菌落特点。在角膜激光显微镜下，该菌落由细小、高反光、颗粒状的的孢子构成，聚集呈团块状(图12，13)。

图1 白色箭头处显示溃疡灶内有少量孢子出现，在共焦显微镜下孢子非常细小，直径在1 μm以下，为中-高反光的细小颗粒状结构。上图右侧是角膜上皮细胞，黑色箭头处显示溃疡的边界 图2 显示角膜激光共焦显微镜下，溃疡灶处有大量孢子出现(大量、细小、中-高反光的颗粒状结构)，但尚未聚集成团。上图的下方是角膜上皮细胞，黑色箭头处显示溃疡灶的边界 图3 显示角膜激光共焦显微镜下，溃疡灶中大量孢子出现(大量、细小、中-高反光的颗粒状结构)，但尚未聚集成团。上图的上方可见角膜基质细胞 图4 显示角膜激光共焦显微镜下，溃疡灶中的大量孢子，黑色箭头处的条索状结构为角膜显微缝线，该显微缝线周围有较多的孢子出现。白色箭头处显示脱落的角膜上皮细胞 图5 白色箭头处显示大量真菌孢子聚集成不同形状的高反光、近圆形、团块状结构，其内可见大量细小的、高反光颗粒状孢子结构。上图的下方是角膜基质结构 图6 白色箭头处显示大量真菌孢子聚集成形状不规则的、高反光、团块状结构，其内可见大量细小的、高反光颗粒状孢子结构。上图的左下方是角膜基质结构 图7 显示大量真菌孢子聚集成更大的、形状不规则的、高反光、团块状结构，该团块状结构是由大量细小的、高反光颗粒状孢子结构聚集构成 图8 显示团块状结构进一步融合为更大片的团块状结构，其内有大量细小的、高反光颗粒状孢子结构聚集 图9 白色箭头处显示团块状结构进一步融合为更大片的团块状结构，大量孢子在团块状结构中央聚集叠加，影响激光穿过成像，为暗反光结构，其内成像不清。在这里团块状结构的周边部，孢子密度较小，激光仍能通过成像，可见周边有大量聚集的、细小、高反光颗粒状孢子聚集 图10 显示大量孢子聚集成弧形、条状的团块状结构，中央有孢子大量聚集、叠加形成的暗区，周边可见大量颗粒状的孢子聚集。白色箭头处显示较多孢子聚集、折叠形成类似孢子团的边界结构 图11 显示孢子大量聚集、叠加形成的暗区，其右上方孢子密度较低，可见大量颗粒状的孢子聚集。上图的左侧及下方可见角膜基质结构 图12 共焦显微镜下可见大量、细小、颗粒状的孢子聚集成团块状，形态不规则。在上图的背景中可见将孢子涂抹于角膜接触帽时产生的刮痕，呈暗反光、细条状结构 图13 大量、细小、颗粒状的孢子聚集成团块状，形态不规则。背景中可见将孢子涂抹于角膜接触帽时产生的刮痕，呈暗反光、细条状结构 图14 显示较多、细小的孢子悬浮于溃疡周围角膜条状的小凹里 图15 显示较多脱落的孢子悬浮于溃疡灶的积液里，上图的左边可见积液的液气交界面。

三、近平滑假丝酵母菌的孢子从生长处脱落下来，可以悬浮于溃疡灶的积液或者附近角膜小凹的积液里(图14，15)。

四、根据上述图片分析，真菌性角膜溃疡灶中的孢子和培养出的真菌菌落涂片的孢子在角膜激光共焦显微镜上的图像基本一致。

讨 论

假丝酵母菌是我国真菌性角膜溃疡致病菌中的一类，其广泛存在于人体皮肤、口腔、阴道等处，是典型的条件致病菌。人体致病的假丝酵母菌属有4～5种，致病力最强的是白色念珠菌(白假丝酵母菌)，该酵母菌的孢子及菌丝均可致病；第二为热带假丝酵母菌，第三为近平滑假丝酵母菌位，第四为伪热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌等[6]。在假丝酵母菌属中，临床上眼科最常见是白色念珠菌，临床报道最多。近平滑假丝酵母菌相对较为少见，国内临床上有零星报道[7-9]，国外报道较多[10-24]，其在人体眼部常规情况下仅产生孢子，是孢子致病的酵母菌。同时在临床检验室常规真菌培养条件下，土豆葡萄糖培养基和沙氏培养基38 ℃或28 ℃ 培养3～21 d，其菌落中也只出现孢子，不出现菌丝。真菌孢子刮片情况下，不容易与眼部的组织碎屑鉴别，早期刮片容易漏诊。通过共焦显微镜研究真菌孢子在活体下的特点[1-14]，有助于我们早期发现诊断该类孢子致病的真菌性角膜溃疡。

我们搜集了10年间在本院确诊的11例近平滑假丝酵母菌所致的真菌性角膜溃疡，其孢子在角膜溃疡灶中有如下特点：(1)在溃疡灶中的孢子在共焦显微镜下是中-高反光的细小颗粒状结构，孢子非常细小，直径在1 μm以下，非常容易与溃疡灶中的杂质或者药物粉尘颗粒混淆；孢子未聚集成团时，在溃疡灶中的分布可多可少，参见图1～4；(2)当病情发展，真菌孢子可以聚集成团块状，这种真菌孢子聚集的团块大小不一，形态不规则，参见图2～8，但其中可见大量密集聚集的孢子颗粒结构；(3)当病情进一步发展，孢子不断聚集，还会叠加增厚，增厚严重的区域可以阻挡激光的进入，从而影响成像，参见图[9-11]

将培养的菌落涂抹于角膜接触帽的外表面，采用激光共焦显微镜进行观察，可见大量、细小、颗粒状的孢子聚集成团块状，形态不规则，参见图12～13。活体近平滑酵母菌性角膜溃疡灶中的孢子和培养涂片的孢子在角膜激光共焦显微镜图像基本一致，说明角膜激光显微镜在检查活体真菌孢子与涂片后培养的效果基本一致。

酵母菌的孢子非常细小，直径常常在1 μm以下，如不进行HE染色，在显微镜下很难辨认，非常容易于取材时的杂质混淆。而我们常规角膜溃疡刮片取材后，是加一滴3.9 mmol/l的氢氧化钾溶液后，于显微镜下查找真菌菌丝及孢子，常规并不进行HE染色。同时还受限于实验室检查人员对病原菌形态学和生物学特点的认识，对于此类只有孢子而没有菌丝的酵母菌非常容易漏诊。我们掌握了该类孢子在共焦显微镜下的图像特点后，采用共焦显微镜直接检查角膜溃疡灶，可以减少对这类单纯孢子致病的真菌性角膜溃疡的误诊和漏诊。

临床上采用共焦显微镜对溃疡灶进行检查时，应注意以下事项：(1)病灶检查范围至少应包括病灶的中央、周围浸润灶与透明角膜交界区的上、下、鼻和颞侧5个检查点；(2)在患者配合地情况下，共焦显微镜镜头最好绕溃疡灶检查一周，以免遗留死角；(3)溃疡灶中角膜坏死碎屑较多，组织水肿严重，背景反光强时，应反复调整共聚焦显微镜的对焦平面，将孢子从强背景中区别开来，避免假阴性结果；(4)当溃疡灶中的孢子较多时，可以脱落悬浮于溃疡灶的积液中或者角膜上的小凹液体中，参见图[14，15]，我们在进行共焦显微镜检查时，如果发现这种情况，应在溃疡灶处仔细检查，以免漏诊；(5)患者如使用过那他霉素滴眼液，药物粉尘颗粒覆盖在溃疡灶表面会影响孢子的观察，可以用生理盐水将溃疡灶表面的药物粉尘冲洗后再进行检查，以提高检查的阳性率[2-14]。

角膜激光共焦显微镜在我国眼科的临床应用较为广泛，是早期诊断真菌性角膜溃疡及指导临床治疗的新型设备仪器，其对真菌菌丝所致的角膜溃疡诊断阳性率高，检查时间短，同时对眼部组织无损伤，可以反复进行，有其特有优势。而对于孢子致病的真菌性角膜溃疡，临床报道较少。近平滑假丝酵母菌是单纯孢子致病的一类真菌，临床上较为少见，同时致病孢子的直径太小，容易与溃疡灶中的杂质混淆。通过对比活体溃疡灶中孢子特点和培养孢子在共焦显微镜下的特点，有助于我们减少对该类孢子致病的真菌性角膜溃疡的漏诊，提高诊治水平。角膜激光共焦显微镜检查活体真菌性角膜溃疡的孢子与培养的效果基本一致，在孢子致病的真菌性角膜溃疡的研究和临床诊断方面是十分有用的工具[3-18]。